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目的:肺癌在恶性肿瘤中的发病率与死亡率均位居前列,严重威胁着人类身心健康,实现肺癌的早期诊断对于肺癌患者的治疗和预后评估意义重大。目前临床工作中用于肺癌诊断的生物标志物众多,但其敏感性及特异性都不高,对于肺癌早期诊断和治疗仍有一定局限性。本研究组的前期研究中,已经筛选出一些与非小细胞肺癌相关的肿瘤抗原。本研究在此基础上进一步优化设计了一些新的肿瘤相关抗原,在单个抗原检测的基础上,探索进行肿瘤相关抗原的联合检测,以期寻找到对非小细胞肺癌早期诊断有高敏感性和高特异性的生物学标志物,并为非小细胞肺癌的治疗及预后评估提供一定的指导意义。方法:1.设计抗原多肽:从NCBI数据库检索HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1的完整氨基酸序列,利用生物信息学数据库和在线工具(http://www.iedb.org)设计并合成了7个线性抗原多肽,制备了9种抗体检测试剂盒,其中7种由单价抗原多肽制备而成,即HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1;另外2种分别由3个独立抗原多肽混合后制备而成,即HER2-MUC1-VEGFR1和CD25-MUC1-VEGFR1。其中CD25是在我们前期研究中发现的与非小细胞肺癌诊断和预后密切相关的生物标志物。2.检测血浆中天然自身抗体水平:选取211例未经任何抗癌治疗的首次诊断为非小细胞肺癌患者作为实验组研究对象,同期选取200例健康受试者作为对照组,利用ELISA方法检测并比较两组血浆中天然自身抗体水平。同时,将研究对象分别按照性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期进行分组,研究血浆中天然自身抗体水平与性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期的关系。3.筛选血浆:收集150例健康献血者的血浆,应用ELISA方法分别检测血浆中HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体水平。选择天然自身抗体水平排名首位的健康献血者血浆命名为阳性组;选择天然自身抗体水平排名末位的健康献血者血浆命名为阴性组。上述两种血浆用于后期细胞培养。4.研究富含天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响:应用富含和低含HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体的血浆分别培养非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H2122,应用CCK-8测定两种细胞的增殖,计算细胞活度,研究富含三种天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌增殖的影响。5.检测非小细胞肺癌细胞中HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达:分别提取A549和NCI-H2122的总RNA,应用实时定量PCR方法检测两种肿瘤细胞的HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达。结果:1.成功设计并合成抗原多肽片段,序列如下:HER2: H-kllallppgaastqvctgtdm klrlpasp-OHMUC1: H-crynltisdvsvsdvpfpfsaqsgah-OHVEGFR1: H-dlklsctvnkflyrdvtwillrtvnnrtmhysi-OHABCC5: H-tstsgthrdredskfrrtrplecqdal-OHMYC: H-rvkldsvrvlrqisnnrkcfellptpplsps-OHTNF-α: H-cqlqwlnrranallangvelrdnqlv-OHPOU5F1: H-keleqfakllkqkritlgytqadvgltc-OHCD25: H-iyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesve-OH2.天然自身抗体在非小细胞肺癌患者和健康对照组中的水平变化:(1)比较211例非小细胞肺癌患者和200例健康对照者血浆天然自身抗体水平,发现非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平显著低于对照组(P<0.001)。(2)将非小细胞肺癌患者和健康对照组按照性别分组,分别进行分析,发现女性非小细胞肺癌患者,血浆抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平均显著低于健康对照组(P<0.001);男性非小细胞肺癌患者,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平显著低于健康对照组(P<0.001)。(3)将非小细胞肺癌组和健康对照组按照年龄<60岁和≥60岁进行分组,发现非小细胞肺癌患者血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平在两个年龄组中均显著低于健康对照组(P<0.001),抗VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平仅在<60岁组显著低于健康对照组(P<0.001)。(4)将非小细胞肺癌患者根据组织学病理类型分为腺癌及鳞癌两组,研究发现,与健康对照组比较,腺癌患者(124例)血浆中抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平均显著降低(P<0.001或P<0.05),而鳞癌患者(87例)血浆中仅抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平显著降低(P<0.001或P<0.05)。(5)根据非小细胞肺癌临床分期,将非小细胞肺癌患者分为A组(I期和IIA期)、B组(IIB期)和C组(III期和IV期)三组。研究发现,与健康对照组比较,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平在三组非小细胞肺癌患者中均显著降低(P<0.001),抗VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平在早期和晚期非小细胞肺癌患者中均显著降低(P<0.001;P<0.05),抗MUC1天然自身抗体(IgG)水平仅在早期非小细胞肺癌中显著降低(P<0.05)。3.ROC曲线分析发现,确定特异性为95.0%时,抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)对非小细胞肺癌诊断的敏感性分别为19.0%、19.0%和42.2%,抗CD25-MUC1-VEGFR1三种抗原多肽联合的天然自身抗体(IgG)对早期非小细胞肺癌的检测敏感性高达49.6%。4.Kaplan-Meier生存分析发现,非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关(P>0.05)。5.体外细胞学研究发现,经过抗HER2天然自身抗体(IgG)阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力显著低于阴性血浆处理组(P<0.05),A549细胞活力高于阴性血浆处理组(P<0.05);经过抗MUC1或抗VEGFR1阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力均显著低于阴性血浆处理组(P<0.001),A549细胞活力无显著差异(P>0.05)。6.肿瘤相关基因表达研究发现,NCI-H2122细胞中HER2、MUC1和VEGFR1基因mRNA表达水平均显著高于A549细胞(P<0.001)。结论:1.非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平显著低于健康对照组,提示血浆抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平可作为非小细胞肺癌的生物标记。2.非小细胞肺癌患者血浆中抗CD25-MUC1-VEGFR天然自身抗体(IgG)对早期非小细胞肺癌诊断的敏感性最高,达到49.6%。因此,抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)联合检测有望成为非小细胞肺癌早期诊断新的生物标记。3.血浆中抗MUC1天然自身抗体(IgG)水平在早期非小细胞肺癌中显著降低,提示抗MUC1天然自身抗体(IgG)可能对早期非小细胞肺癌具有一定的诊断价值;在女性非小细胞肺癌患者显著低于健康对照组,提示抗MUC1天然自身抗体(IgG)水平可能对女性非小细胞肺癌患者具有一定的诊断意义。4.血浆中抗HER2和抗MUC1天然自身抗体(IgG)在肺腺癌患者中显著低于健康对照组,提示抗HER2和抗MUC1天然自身抗体(IgG)可能对肺腺癌具有一定的诊断价值。5.非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体(IgG)水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关,对判断非小细胞肺癌患者预后无指导意义。6.富含抗HER2、抗MUC1或抗VEGFR1天然自身抗体的血浆可显著抑制NCIH2122细胞增殖。提示含有天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌可能具有潜在的治疗作用。7.NCI-H2122细胞HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA表达显著高于A549细胞,这就是为什么富含HER2、MUC1和VEGFR1天然自身抗体的血浆抑制NCI-H2122细胞增殖作用比A549细胞更强的原因。