透明质酸是生物体内普遍存在的一种线性粘多糖物质，已被广泛运用于关节 疾病治疗和眼科手术等医学领域中。然而，由于天然透明质酸在体内存留的时间 较短，大大限制了其疗效的发挥，尤其是近年来在预防粘连和软组织填充等方面 的应用，要求透明质酸在体内应具有适宜的存留时间，有时甚至要求在体内长期 存留，由此激发了研究者对天然透明质酸结构改造工作的兴趣。对透明质酸的化 学修饰研究工作可追溯至60年前，将透明质酸制成衍生物应用于临床上的研是 由Balazs等首先开始的。 透明质酸分子中的四个部分一羟基、N-乙酰氨基、羧基和还原末端均可被化 学修饰，但目前报道的衍生物的制备多为对其羟基和羧基进行的研究工作。本文 的研究重点：参照聚乙二醇修饰蛋白质的反应机理，利用聚乙二醇对透明质酸上 的N-乙酰氨基进行化学修饰，研究所得到的衍生物的各种材料学性能和生物学 性能。实验路线：首先利用碳二亚胺、乙二酸二酰肼和聚乙二醇三种不同的交联 试剂对透明质酸进行化学修饰，对三种衍生物的结构、溶胀性和特性粘度进行比 较，分析不同交联剂修饰得到的衍生物的特点及其各种交联剂本身的优点和劣 势；其次主要对聚乙二醇修饰透明质酸上的N-乙酰氨基所得到的衍生物的分子 量、结构、流变学性能、细胞毒性和生物降解性进行测试研究。本论文的主要研 究内容如下 (1)利用红外光谱和拉曼光谱对三种衍生物的反应机理进行分析和确认，可 证实HA-EDC、HA-ADH的交联是通过HA中羧基与EDC、ADH进行反应的，而在碱 性条件下活化的PEG与HA上的N-乙酰氨基发生酯化反应。在本试验条件下，反 应2h交联反应的交联度可以根据交联剂的用量、反应条件(反应时间、pH值等) 加以控制。在溶胀性试验中，衍生物的溶胀度均在5-61之间，具有很好的保水 性。在碱溶液中HA-EDC产物发生降解，并且降解程度大于HA原粉；HA-ADH产 物不溶于碱性溶液，说明在碱性条件下其抗降解性能良好；HA-PEG衍生物在碱 溶液中的抗降解性大于HA原粉的抗降解性。 (2)本实验中利用活化的PEG在室温条件下与HA发生反应。对活化PEG反应 而言，利用红外光谱和拉曼光谱证实其反应确已发生，并研究在有无催化剂、不 同反应时间和不同反应温度下PEG被酯化的转化率的大小，从而选定活化PEG的 最佳反应条件，即在吡啶催化作用下，100℃，反应4h为其最佳反应条件。 (3)本试验利用膜渗透法计算HA-PEG衍生物和HA原粉的数均分子量。通过 计算可知：HA衍生物的数均分子量值均小于HA原粉的数均分子量值；反应12h 得到的衍生物的分子量远远大于反应18h时得到的衍生物的分子量。已知本实验 所用HA原粉的Mw为1.54×106，而计算所得HA的Mn分子量为88.58×104， 究其原因：因为(-M)n＜(-M)w，同时由于实验中不可避免地存在误差以及截距值取 得的准确性也存在误差。 (4)透明质酸的结构对其流变学性能和生物学性能有重要的影响，直接决定 它在临床医学领域的应用效果和发展前途。通过扫描电镜观测可知HA-PEG衍生 物保持着交联形态，分子聚集成长的细丝，相互缠绕，进而再分枝构成不规则的 蜂巢状，且其相对致密度较高；利用圆二色谱进一步证实HA-PE具有螺旋构象、 折叠构象、转角和随机结构等二级结构构型和网状三级结构构型。 (5)在HA-PEG衍生物流变学性能研究中，首先对不同反应时间(6h、12h、 18h和24h)、不同PEG分子量(400、6000、20 000)及不同PEG/HA摩尔比(1/10、 1/5、1/3、1/2)所得到的衍生物的特性粘度和动力粘度进行测试，并从反应交 联度和分子结构角度对其测试结果进行分析讨论；其次研究了衍生物的粘度和剪 切速率以及弹性模量和粘性模量之间的关系，以及粘性溶液与弹性体之间的转换 关系。当PEG Mr6000，PEG/HA=1/10时，反应12h时，HA-PEG衍生物的特性粘 度最大；当PEG/HA=1/10，反应18h时，随着PEG分子量的增大，衍生物的特性 粘度减小，但其动力粘度却增大；HA-PEG溶液是标准的假塑性非牛顿流体，溶 液的粘度与其质量分数呈正相关系，粘度和弹性与溶液质量分数也成正比关系； 溶液由低振荡频率向高振荡频率转换的同时也由粘性体向弹性体的转换；且随着 溶液质量分数的增大，交叉点频率逐渐降低，使溶液的弹性特征增强。 (6)在细胞毒性实验中，利用倒置相差显微镜观察各组细胞在培养1d、2d、 4d、6d、8d和10d时细胞生长形态及细胞增殖率变化可知，随着时间的延长， 实验组细胞进一步生长，分化和增殖，细胞数量逐渐增加，细胞生长形态正常， 贴壁生长良好。细胞毒性分别均为1级，总体评级为1级，细胞平均增殖率为 95.49％，完全符合生物材料的应用要求。初步研究证实，以PEG作为交联剂交联 制备的HA衍生物材料的细胞相容性较好。 (7)三种不同摩尔比所制备的HA衍生物薄膜在磷酸盐缓冲溶液中浸泡10d 的重量保持率在98.6％-90％之间，且随浸泡时间的延续，重量保持率减少。同HA 降解率相比，HA-PEG衍生物的体外生物降解性能比HA要好一些，平均说来HA-PEG 衍生物的重量保持率比HA高，且随着PEG/HA摩尔比越大，其抗降解性越好。 综上所述，本论文重点通过利用活化的聚乙二醇对透明质酸上的N-乙酰氨 基进行化学修饰得到HA-PEG衍生物，并对其结构，溶胀性，流变学性能，细胞 毒性和生物降解特性进行试验研究，初步证实，同HA相比，利用此方法得到的 HA衍生物其抗降解性能已经得到改善，并且保留了HA良好的流变学性能和生物 相容性，具有极高的医学再研究价值和使用价值。 关键词：透明质酸，透明质酸衍生物，三级结构，流变学性能，细胞毒性，生物降解性