论文部分内容阅读
背景及目的：YWHAZ属于14-3-3基因家族，它在信号传导、细胞周期、细胞凋亡的调控等方面发挥重要作用。其在肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤发生发展的作用已得到初步证实。一些最新研究发现YWHAZ还参与细胞粘附机制，但在肿瘤迁移方面的作用鲜有报道。本实验将构建YWHAZ过表达腺病毒及YWHAZ过表达逆转录病毒，在293T细胞中验证基因表达情况，划痕实验探究过表达YWHAZ对肿瘤细胞迁移能力的影响。为进一步研究YWHAZ基因在肿瘤迁移方面的作用奠定基础。方法：1.构建YWHAZ腺病毒：将YWHAZ基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV-IRES-GFP，酶切鉴定、PCR扩增及碱基测序验证重组质粒。构建YWHAZ腺病毒并用293T细胞扩增病毒。2.构建YWHAZ逆转录病毒：将YWHAZ基因亚克隆至逆转录病毒穿梭质粒PLXSN-IRES-GFP，酶切鉴定、PCR扩增及碱基测序验证重组质粒。用Ampho293细胞包装YWHAZ逆转录病毒并用G418筛选稳转细胞系。3.病毒感染效果分析：分别用YWHAZ腺病毒、YWHAZ逆转录病毒感染293T，24、48、72小时后观察绿色荧光表达情况，验证病毒侵染效果。4.过表达目的基因分析：RT-PCR比较病毒感染的293T细胞与正常293T细胞中YWHAZ的差异。5.细胞迁移能力分析：YWHAZ腺病毒分别感染乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞A549，划痕实验检测过表达YWHAZ基因对肿瘤迁移能力的影响。结果:1.验证YWHAZ腺病毒：酶切pacAd5CMV-YWHAZ-GFP重组质粒，获得约700bp(YWHAZ)、7k（b载体）片段，PCR扩增得到约700bp(YWHAZ)的条带，重组质粒碱基测序正确。同源重组获得YWHAZ腺病毒，纯化测滴度后获得滴度为4×108unit/ml的病毒。2.验证YWHAZ逆转录病毒：酶切PLXSN-GFP-YWHAZ重组质粒，获得约700bp(YWHAZ)、7kb（载体）片段，PCR扩增得到约700bp(YWHAZ)的条带，重组质粒碱基测序正确。Ampho293细胞包装逆转录病毒，G418筛选出稳定产生病毒的Ampho293细胞。3.病毒感染效果分析：分别用YWHAZ腺病毒及逆转录病毒感染293T细胞，72小时观察细胞绿色荧光表达最强，分别有90%、70%细胞表达绿色荧光。两种重组病毒可高效感染目的细胞。4.过表达目的基因分析：RT-PCR结果显示与293T细胞相比，YWHAZ腺病毒及YWHAZ逆转录病毒感染的293T细胞在mRNA水平高表达YWHAZ。5.细胞迁移能力分析：划痕实验证明YWHAZ腺病毒感染的MDA-MB-231细胞、A549细胞向划痕中部生长速率明显快于未加病毒的对照组细胞，YWHAZ可促进肿瘤细胞迁移。结论：1.成功构建了YWHAZ腺病毒、逆转录病毒。2.两种病毒可顺利、高效感染目的细胞，特异性增强目的细胞中YWHAZ的表达。3.YWHAZ可增强乳腺癌及肺癌细胞的迁移能力，对肿瘤转移有重要促进作用。