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研究背景：
脑卒中(cerebral stroke)是一种具有发病率高、致残率、高死亡率高为特征的急性脑血管疾病，其分为出血性和缺血性脑卒中(其中缺血性脑卒中占约80%)。缺血性脑卒中是由于大脑中出现局部血流的短暂或永久性中断，导致相应区域的脑损伤或脑梗死，进而引起意识、运动、语言等脑功能受损，甚至危机生命。及时溶栓或取栓使堵塞的血管再通，恢复脑部供氧供能是治疗脑缺血的最有效手段。但是血氧供给恢复会造成损伤部位的继发的脑缺血损伤，即脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，I/R)损伤。I/R损伤过程是一个复杂的级联反应，涉及多种损伤机制，如细胞内Ga2+超载，氧化应激，兴奋性氨基酸毒性，线粒体供能受损，炎症小体形成，炎症通路及各种膜受体以损伤相关分子模式被激活等，多种因素导致细胞凋亡、自噬。目前，能够有效治疗脑缺血再灌注损伤的方法和药物十分有限，因此其发病机制及防治措施的研究仍是亟待解决的科学问题。
microRNAs(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。miRNAs在个体发育、细胞增殖、分化、衰老及肿瘤形成等多种生理、病理过程中都起到重要的调控作用。近年来研究指出，miRNAs参与脑卒中的发生、发展过程。既往研究已证实，miRNAs通过与靶基因mRNA(messenger RNA)的3’非编码区(3’Untranslated Region ，3’ UTR)相结合导致mRNA的降解或翻译抑制，而且miRNA的转录后效应更快，并能同时调节下游许多靶基因。因此，miRNAs可能是治疗脑卒中潜在靶点。
本团队研发的植物单体新药KP-4是异甜菊醇的衍生物，具有比较理想的水溶性以及生物利用度。已有证明KP-4对大脑中动脉栓塞再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)小鼠具有神经保护作用，同时也有研究表明KP-4能通过miRNA-181b/CYLD对小鼠局灶性脑缺血发挥神经保护作用。但是KP-4是一个多靶点药物，而且其保护作用的机理还没有完全阐明，因此本课题的研究意义在于更加深入的探究KP-4在脑缺血再灌注损伤中对miRNA的影响以及其潜在的作用机制。从而为KP-4临床给药带来新的理论及实验基础，同时也为寻找脑缺血标志物和潜在的药物靶点提供了新思路。
目的：
本研究旨在探究KP-4对缺血再灌注损伤中异常miRNA及miRNA靶基因的影响，并研究其潜在的分子作用机制。
方法：
1.通过脑梗死体积变化、病理学改变、行为学变化构建小鼠MCAO/R损伤模型以及确定KP-4体内给药浓度；同时通过CCK8、流式细胞分析构建N2a细胞氧糖剥夺再复灌(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)损伤模型及确定KP-4体外给药浓度。
2.通过miRNA测序、WesternBlot(WB)、Real-timePCR(RT-PCR)、流式细胞分析等方法，在体内外水平探究KP-4对miRNA的影响及对miRNA的作用进行分析；
3.利用生物信息学分析、细胞转染、WB、荧光素酶报告基因实验对miR-219a-5p的靶基因进行筛选及验证；
4.WB、RT-PCR、流式细胞分析等方法分析miR-219a-5p/PDE4D信号通路的作用及KP-4对此信号通路的影响。
结果：
1．在体内外水平发现，KP-4对缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用；
2．在缺氧/缺血再灌注损伤过程中，KP-4能够通过上调miR-219a-5p表达对体内外缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用；
3．miR-219a-5p可通过作用于PDE4D-3’UTR的靶序列靶向调节PDE4D的表达；
4．KP-4能通过miR-219a-5p/PDE4D信号通路对OGD/RN2a细胞发挥神经保护作用。
脑卒中(cerebral stroke)是一种具有发病率高、致残率、高死亡率高为特征的急性脑血管疾病，其分为出血性和缺血性脑卒中(其中缺血性脑卒中占约80%)。缺血性脑卒中是由于大脑中出现局部血流的短暂或永久性中断，导致相应区域的脑损伤或脑梗死，进而引起意识、运动、语言等脑功能受损，甚至危机生命。及时溶栓或取栓使堵塞的血管再通，恢复脑部供氧供能是治疗脑缺血的最有效手段。但是血氧供给恢复会造成损伤部位的继发的脑缺血损伤，即脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，I/R)损伤。I/R损伤过程是一个复杂的级联反应，涉及多种损伤机制，如细胞内Ga2+超载，氧化应激，兴奋性氨基酸毒性，线粒体供能受损，炎症小体形成，炎症通路及各种膜受体以损伤相关分子模式被激活等，多种因素导致细胞凋亡、自噬。目前，能够有效治疗脑缺血再灌注损伤的方法和药物十分有限，因此其发病机制及防治措施的研究仍是亟待解决的科学问题。
microRNAs(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA。miRNAs在个体发育、细胞增殖、分化、衰老及肿瘤形成等多种生理、病理过程中都起到重要的调控作用。近年来研究指出，miRNAs参与脑卒中的发生、发展过程。既往研究已证实，miRNAs通过与靶基因mRNA(messenger RNA)的3’非编码区(3’Untranslated Region ，3’ UTR)相结合导致mRNA的降解或翻译抑制，而且miRNA的转录后效应更快，并能同时调节下游许多靶基因。因此，miRNAs可能是治疗脑卒中潜在靶点。
本团队研发的植物单体新药KP-4是异甜菊醇的衍生物，具有比较理想的水溶性以及生物利用度。已有证明KP-4对大脑中动脉栓塞再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)小鼠具有神经保护作用，同时也有研究表明KP-4能通过miRNA-181b/CYLD对小鼠局灶性脑缺血发挥神经保护作用。但是KP-4是一个多靶点药物，而且其保护作用的机理还没有完全阐明，因此本课题的研究意义在于更加深入的探究KP-4在脑缺血再灌注损伤中对miRNA的影响以及其潜在的作用机制。从而为KP-4临床给药带来新的理论及实验基础，同时也为寻找脑缺血标志物和潜在的药物靶点提供了新思路。
目的：
本研究旨在探究KP-4对缺血再灌注损伤中异常miRNA及miRNA靶基因的影响，并研究其潜在的分子作用机制。
方法：
1.通过脑梗死体积变化、病理学改变、行为学变化构建小鼠MCAO/R损伤模型以及确定KP-4体内给药浓度；同时通过CCK8、流式细胞分析构建N2a细胞氧糖剥夺再复灌(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)损伤模型及确定KP-4体外给药浓度。
2.通过miRNA测序、WesternBlot(WB)、Real-timePCR(RT-PCR)、流式细胞分析等方法，在体内外水平探究KP-4对miRNA的影响及对miRNA的作用进行分析；
3.利用生物信息学分析、细胞转染、WB、荧光素酶报告基因实验对miR-219a-5p的靶基因进行筛选及验证；
4.WB、RT-PCR、流式细胞分析等方法分析miR-219a-5p/PDE4D信号通路的作用及KP-4对此信号通路的影响。
结果：
1．在体内外水平发现，KP-4对缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用；
2．在缺氧/缺血再灌注损伤过程中，KP-4能够通过上调miR-219a-5p表达对体内外缺氧/缺血再灌注损伤发挥保护作用；
3．miR-219a-5p可通过作用于PDE4D-3’UTR的靶序列靶向调节PDE4D的表达；
4．KP-4能通过miR-219a-5p/PDE4D信号通路对OGD/RN2a细胞发挥神经保护作用。