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樟树(Cinnamomum camphora L.)原产于中国,其树形优美、木材致密、固土防沙、吸烟滞尘、抗逆性强,是一种重要的经济林木和园林绿化树种。但由于其结实量大、花粉飘散,污染环境,影响城市环境和行人,在一定程度上限制了其应用和推广。为了减少樟树果实造成的环境污染,同时减少飘散于空气中的花粉对人体健康造成的危害,扩大樟树从南至北的种植范围,利用植物基因工程技术培育无果和抗寒樟树是解决这些问题的有效途径。因樟树幼年期长,需多年才能达到成熟,为了早日看到樟树转化Barnase不育基因后植株在表型及生理上的变化,同时进行了樟树转化PaFT早花基因及Barnase-PaFT复合基因的研究。 本研究在前人基础上,首先对樟树的体细胞胚再生体系进行了优化,深入探讨了影响樟树体细胞胚发生、成熟和萌发的因素。并利用相关试验设计完善了其遗传转化体系。研究的主要结果如下: 1.优化了樟树的体细胞胚再生体系。结果表明: (1)合子胚直径大小显著影响体细胞胚诱导率:直径为1.5-2.0mm、1.0-1.5mm、0.5-1.0mm的合子胚的体细胞胚诱导率分别为46.67%、52.00%、26.67%,综合分析,采用直径1.0-1.5mm的合子胚较为适宜。 (2)母树基因型显著影响体细胞胚诱导率:两棵不同母树的体细胞胚诱导率分别为79.78%和32.42%。 (3)光照条件显著影响体细胞胚诱导率:光照条件和黑暗条件下的体细胞胚诱导率分别为79.78%和53.74%,应在光照条件下对体细胞胚进行诱导。 (4)不同种类的渗透剂显著影响体细胞胚诱导率:0.5M和1.0M的蔗糖、麦芽糖、甘露醇溶液中,0.5M麦芽糖与0.5M蔗糖溶液对体细胞胚的诱导率无显著差异,分别为69.05%和79.98%,但0.5M蔗糖溶液诱导得到的平均体细胞胚数较多。综合分析,0.5M蔗糖溶液的诱导效果最佳。 (5)合子胚手术不仅无益于体细胞胚的诱导,也无用于胚性愈伤的诱导,在樟树体细胞胚的诱导中还是采用全胚接种的方式较为适合。 (6)添加BA和毒莠定不利于樟树细胞胚的诱导,也不利于其胚性愈伤组织的诱导。 (7)不同浓度的NAA和2,4-D对樟树胚性愈伤组织的诱导效果不同:综合来看,樟树胚性愈伤组织的诱导应采用基因型较为适宜的胚性系,诱导培养基采用添加1.0mg/L NAA的MS培养基。 (8)PEG、低温和干化处理对体细胞胚的成熟与萌发有一定作用:低温处理5周可以使体细胞胚的萌发率达到22.96%,显著提高了樟树体细胞胚的萌发潜力;干化处理5d时体细胞胚的萌发率达到最高,正常芽叶百分率达到42.74%,与其他干化处理的结果存在显著性差异;低温处理和干化处理相结合的效果并不理想;在4℃低温下,不同浓度的PEG6000没有显著提高体细胞胚的萌发率,对樟树体细胞胚的成熟和萌发并没有显著作用。 2.通过根癌农杆菌介导Barnase-PaFT,PaFT和PmCBFb转化樟树胚性愈伤组织,分别获得转化Barnase-PaFT和 PaFT的抗性植株,PCR检测表明:转化Barnase-PaFT有4个株系检测到目标条带,而转PaFT基因有1个株系检测到目标条带。初步表明Barnase-PaFT、PaFT基因已转入樟树基因组中,转化PmCBFb的体细胞胚正在成熟萌发处理之中。