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微生物源示踪技术(Microbial source tracking, MST)是一种以环境微生物学、生态学和遗传学为理论依据,用分子和生化的手段,分析粪便指示因子的特异性指纹图谱,进而确定水体中以粪便污染为主的非点源污染来源的新技术。它不仅能够正确地识别受粪便污染水体的真正污染来源,还能评价各已知污染源的污染贡献率,被专家们认为将成为治理非点源粪便污染的有力工具。本课题基于REP-PCR技术,对库依赖与非库依赖微生物源示踪技术进行比较与应用。通过实践与总结,为进一步的研究以及国家管理部门监测与管理非点源粪便污染提供理论依据。目的采集大连与济南粪便样本进行库依赖与非库依赖微生物源示踪,从而比较两种类型微生物源示踪技术的准确性与稳定性。为验证该方法受地理性差异的影响,采集济南水体样本进行库依赖与非库依赖微生物源示踪,对不同污染来源贡献率进行评价,检验两种方法的实际应用价值。方法本课题以大连和济南为采样点,采用无菌操作采集鸡、犬、牛、猪、人五种来源粪便样本,以及济南水体样本,并选用大肠杆菌(E.coli)标准菌株ATCC25922为对照。采用伊红美蓝(EMB)鉴别试验、糖发酵试验、IMVIC试验,对样本中E.coli进行分离与鉴定。采用EasyPure Genomic DNA Extraction Kit试剂盒提取DNA,并用紫外分光光度计分别测定OD600、OD260、OD280鉴定DNA纯度。从而保证为REP-PCR (细菌基因组重复序列PCR)扩增提供足够DNA模板。采用REP-PCR技术对所提取DNA进行扩增,并使用凝胶图像分析系统(Gel image analysis system,美国UVP公司)采集DNA指纹图谱。采用ALPHAVIEW软件将采集的DNA指纹图谱转化为数字化的DNA指纹图谱,其中包含条带位置、大小、相对亮度、灰度、面积等信息。采用SPSS软件对数字化的DNA指纹图谱进行源示踪,对DNA指纹图谱进行库依赖与非库依赖微生物源示踪,比较相同地区、不同地区的不同类型微生物源示踪准确率与平均源示踪准确率,用相同方法对所采集水样中分离得到的E.coli样本进行微生物源示踪,判断不同宿主来源非点源污染的贡献率。结果采用无菌操作取得粪便样本共380份,其中大连210份、济南170份。另有济南水样15份,经分离、鉴定共获得E.coli菌株1171份其中大连616份、济南555份。经REP-PCR基因扩增,共获得产物1171份,DNA条带多分布于100bp至5000bp之间,其中以500bp“2000bp之间最多。同种宿主来源的样本存在更多的共有特征条带,不同地区同种宿主来源的样本其特征条带存在一定的差异,但仍可见共有的特征条带。剔除重复的DNA指纹图谱以避免偏倚,剔除后剩余DNA指纹图谱889份,其中大连500份,济南389份。通过ALPHAVIEW软件将DNA指纹图谱进行数字化后,采用SPSS软件进行示踪。对500株大连E. coli样本进行库依赖与非库依赖源示踪,库依赖方法RCC分别为鸡源94.9%、犬源95%、牛源99.1%、猪源94%、人源95.1%,ARCC为95.8%；非库依赖法RCC分别为鸡源67.9%、犬源74.0%、牛源65.5%、猪源66.7%、人源33.6%,ARCC为60.0%。对389株济南E. coli样本进行库依赖与非库依赖源示踪,库依赖方法RCC分别为鸡源98.5%、犬源97.1%、牛源100%、猪源96.9%、人源98.3%,ARCC为98.2%；非库依赖法RCC分别为鸡源78.8%、犬源50.0%、牛源75.3%、猪源71.9%、人源62.1%,ARCC为66.8%。对大连与济南共889株E. coli样本进行库依赖与非库依赖源示踪,库依赖方法RCC分别为大连-鸡源92.4%、大连-犬源90.0%、大连-牛源88.5%、大连-猪源89.3%、大连-人源85.2%、济南-鸡源87.9%、济南-犬源92.9%、济南-牛源97.3%、济南-猪源97.5%和济南-人源90.5%,ARCC为89.9%。非库依赖法大连-鸡源60.5%、大连-犬源48.0%、大连-牛源58.4%、大连-猪源12.3%、大连-人源23.8%、济南-鸡源74.7%、济南-犬源41.4%、济南-牛源56.2%、济南-猪源65.6%和济南-人源57.8%,ARCC为47.7%。对水样中的E.coli分别进行库依赖法源示踪和非库依赖法源示踪,结果均表明非点源粪便污染主要为未知来源,贡献率约为30%(非库依赖法)到70%(库依赖法),其次为人源,再次为鸡源与犬源。结论本课题结果表明基于REP-PCR法的微生物源示踪技术具有较高的可靠性,在不同类型的源解析方法下源示踪准确率绝大多数高于60%,特别是库依赖的源解析方法下源示踪准确率表现优秀,对于同一地区样本可达94%以上,对于不同地区样本在85%以上。库依赖法受到地理性差异影响小于非库依赖法,适宜更大范围的应用。同时结果还表明小清河沿岸的非点源污染类型除未知来源外主要为人类粪便,其次为鸡源与犬源,这一结论与当地实际情况较为符合。本课题研究结果为下一步微生物源示踪技术的研发以及应用提供了参考。