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目的:
评价两种经分子筛涂层处理的泡沫SiC,即Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC的体外生物活性和细胞相容性,并初步探索其促进成骨的机制及作为骨替代材料的可行性。
方法:
1、分组:实验组为Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC,对照组为泡沫SiC。
2、采用扫描电镜直接观察三种材料的表面形貌。
3、采用自动物理吸附仪对三种材料进行比表面积测量。
4、采用粒度及Zeta电位检测分析仪测量三种材料的表面电荷情况。
5、采用体外模拟体液浸泡实验表征材料的矿物质沉积能力。
6、采用小牛血清白蛋白吸附实验表征材料的蛋白吸附能力。
7、进行大鼠胎鼠颅骨的成骨细胞的原代培养及鉴定。
8、采用扫描电子显微镜直接观察三种材料表面细胞的黏附及生长状况。
9、MTT比色法分析三种材料对成骨细胞的毒性。
10、碱性磷酸酶含量测定分析三种材料对成骨细胞分化的影响。
结果:
1、扫描电镜观察材料表面形貌可见,泡沫SiC以多边型封闭环为基本单元,各基本单元相互连接形成三维连通网络结构。Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面可见分子筛涂层均匀负载于泡沫SiC陶瓷表面,分子筛晶体取向随机分布,在泡沫SiC陶瓷表面形成连续的涂层。Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面拥有复杂的三维微孔结构,相对更加粗糙。
2、Silicalite-1/泡沫SiC、ZSM-5/泡沫SiC、泡沫SiC的比表面积分别为35±2、25±1、0.2±0.01 m2/g,这说明,Silicalite-1/泡沫SiC与ZSM-5/泡沫SiC拥有比泡沫SiC更大的比表面积。
3、Siliealite-1/泡沫SiC、ZSM-5/泡沫SiC、泡沫SiC的Zeta电位分别为-25.02±1.12、-25.55±1.01、-20.97±0.94 mV,表明Silicalite-1/泡沫SiC与ZSM-5/泡沫SiC表面带有更多的负电荷。
4、仿生矿化实验结果显示:浸泡3d时,三种材料表面均没有沉积物形成;7d时,Silicalite-1/泡沫SiC表面可见少量沉积物,而泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面未见沉积物;14d时,泡沫SiC表面仍未见沉积物,而Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面均可见沉积物。对Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面沉积物做EDX分析,EDX图谱中出现明显的Ca、P峰,说明表面的沉积物是钙磷盐。这表明Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC均能诱导钙磷的形成,具有更好的生物活性。
5、蛋白吸附实验结果显示:Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC表面吸附BSA量明显大于泡沫SiC,说明经分子筛处理的泡沫SiC具有更强的蛋白吸附能力,表现出更好的生物活性。
6、原代成骨细胞培养与鉴定:倒置相差显微镜下可见,培养5d的原代成骨细胞以不规则形、长梭形、三角形为主,相邻细胞彼此贴靠,细胞内及表面开始出现黑色点状分泌物,部分区域出现重叠生长以及辐射生长的现象。经碱性磷酸酶染色,成骨细胞的细胞质呈深蓝色;茜素红将细胞间分泌的钙结节染成红色。
7、扫描电镜观察细胞在材料表面的黏附与生长:黏附早期细胞呈圆梭形、三角形、多角形等多种形态,细胞表面凸凹不平,彼此借伪足相互连接。随着观察时间的延长,细胞数量增加,胞体逐渐增大进一步伸展趋于扁平,细胞包绕在细胞外基质内,边界逐渐模糊。在7d时材料表面几乎被细胞及其细胞外基质覆盖。这说明细胞在三种材料上的黏附及分泌功能良好。
8、MTT结果:三组材料上细胞的MTT值均随着时间逐渐升高。在各个时间点,Silicalite-1/泡沫SiC与ZSM-5/泡沫SiC上细胞MTT值均高于泡沫SiC,且在培养5d和7d时,其差异具有统计学意义(p<0.05)。这说明经分子筛处理的泡沫SiC无明显细胞毒性,具有更好的促进细胞增殖的能力。
9、ALP结果:三组材料上细胞的ALP含量均随着时间逐渐升高。在各个时间点,Silicalite-1/泡沫SiC与ZSM-5/泡沫SiC均高于泡沫SiC,且在7d时,其差异具有统计学意义(p<0.05)。这说明经分子筛处理的泡沫SiC具有更好的促进细胞分化的能力。
结论:
1、Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC具有更好的体外生物活性和细胞相容性,具备成为新一代骨缺损修复材料的可能性。
2、Silicalite-1/泡沫SiC和ZSM-5/泡沫SiC促进成骨的机制可能为:Silicalite-1和ZSM-5分子筛涂层复杂的微晶拓扑形貌、纳米级的三维微孔以及特殊的结构,使得分子筛拥有巨大的比表面积、强大的吸附性能以及优良的离子交换性能,这有利于钙磷的沉积以及蛋白的吸附聚集,表现出更好的生物活性,从而有利于成骨细胞的黏附生长、增殖和分化,从而促进成骨。