【摘 要】
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目的:IL-33/ST2信号通路在肿瘤的发展中起着重要作用,IL-33水平的升高会促进肿瘤细胞的增殖,如乳腺癌,胃癌,结肠癌,肺癌,神经胶质瘤。本文旨在筛选和表达靶向白介素IL-33的纳米抗体,通过与IL-33结合阻断IL-33/ST2信号通路的转导,调节炎症反应并防止肿瘤恶化。方法和结果:（1）IL-33纳米抗体筛选:通过五轮淘洗、富集验证和筛选从大容量天然噬菌体纳米抗体文库中筛选与白介素IL-
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目的:IL-33/ST2信号通路在肿瘤的发展中起着重要作用,IL-33水平的升高会促进肿瘤细胞的增殖,如乳腺癌,胃癌,结肠癌,肺癌,神经胶质瘤。本文旨在筛选和表达靶向白介素IL-33的纳米抗体,通过与IL-33结合阻断IL-33/ST2信号通路的转导,调节炎症反应并防止肿瘤恶化。方法和结果:（1）IL-33纳米抗体筛选:通过五轮淘洗、富集验证和筛选从大容量天然噬菌体纳米抗体文库中筛选与白介素IL-33特异性结合的纳米抗体序列,获得2个氨基酸序列不同的NbIL-33纳米抗体,分别命名为NbA1和NbE12。（2）NbIL-33融合蛋白重组表达菌株构建:利用PCR技术将NbIL-33纳米抗体序列从噬菌体质粒p MECS中扩增出来,通过质粒构建方法将纳米抗体序列连接到表达载体p Mal-c4x中并转化至表达菌株BL21（DE3）,获得NbIL-33与MBP标签蛋白可溶性融合表达菌株。（3）NbIL-33发酵条件优化:用单因素法对NbIL-33融合蛋白在大肠杆菌中表达的诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、培养基等条件进行优化。得出NbIL33融合蛋白的最佳诱导条件是在TB培养基中进行培养,诱导剂IPTG的浓度是0.1 m M,在25℃下诱导。NbA1融合蛋白和NbE12融合蛋白的诱导时间分别是8 h和6 h。（4）NbA1的纯化:使用Ni-NTA亲和层析的方法纯化NbA1融合蛋白,得到NbA1融合蛋白的纯度达到98%,得率为45 mg/L;使用Xa因子蛋白酶特异性切除NbA1融合蛋白的MBP标签,在23℃酶切6 h,蛋白酶切效率达到95%以上;之后通过Ni-NTA亲和层析纯化获得纯度为93%的NbA1纳米抗体。（5）NbE12的纯化:使用MBP Trap HP亲和层析的方法纯化NbE12融合蛋白,得到NbE12融合蛋白的纯度是36%,得率为18.5 mg/L;使用Xa因子蛋白酶特异性切除NbE12融合蛋白的MBP标签,在23℃酶切6 h,MBP标签的切除效率达到95%以上;再通过Ni-NTA亲和层析纯化得到纯度为98%的NbE12纳米抗体。（6）初步鉴定NbIL-33纳米抗体的功能:使用ELISA法,检测NbIL-33的特异性、亲和力和热稳定性;使用CCK8法检测NbIL-33对IL-33诱导人乳腺癌细胞增殖的抑制作用。结果表明,相比于同一家族的其他蛋白,两种纳米抗体均与IL-33结合能力更强;NbE12的亲和力大于NbA1的亲和力;NbA1的热稳定性比NbE12强;NbA1和NbE12对IL-33诱导人乳腺癌细胞增殖均有抑制作用,且NbA1的抑制作用比NbE12强。结论:本研究从天然噬菌体纳米抗体文库中筛选获得了2个靶向IL33抗原纳米抗体序列,并构建了NbIL-33融合蛋白表达菌株,并确定了最佳发酵条件。通过Ni-NTA亲和层析纯化得到纯度大于90%的纳米抗体NbA1和NbE12,且对其生物学功能进行初步研究,为靶向IL-33肿瘤治疗策略的建立奠定基础。
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