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目的:缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是肿瘤适应缺氧微环境的关键因子,可以抑制肿瘤细胞的氧化磷酸化促进糖酵解反应,那么肿瘤缺氧微环境是否影响树突状细胞（Dendritic cell,DC）HIF-1α的表达从而影响DC的糖代谢、表型以及功能的变化目前尚未确定。本课题通过体外缺氧环境培养小鼠DC,系统分析缺氧对DC中HIF-1α表达、糖代谢的重塑、生物学以及免疫学功能的影响,对肿瘤微环境中DC的调控和抗肿瘤免疫进行综合分析。方法:1、培养小鼠骨髓来源的DC,在DC培养第6天给予小鼠黑色素瘤B16-F10细胞冻融抗原冲击,实验分为常氧、缺氧、PX478（HIF-1α抑制剂）处理组,分别进行常氧培养、缺氧（1%浓度O2）培养以及缺氧下PX478处理,第7天收集成熟DC。Western blot检测细胞HIF-1α的表达,q PCR检测葡萄糖转运蛋白体1（Glucose transporter,GLUT1）、己糖激酶2（Hexokinase2,HK2）、丙酮酸激酶2（Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDHA）m RNA表达,紫外分光光度计比色法检测各实验组DC乳酸含量、丙酮酸含量、葡萄糖摄取量、ATP含量、乳酸脱氢酶活力。2、Transwell小室实验检测DC迁移能力,q PCR检测DC趋化因子受体CCR5、CCR7 m RNA表达,流式细胞术检测DC凋亡、DC成熟表型（CD80、CD86、CD40和MHCII）和免疫抑制分子（PD-L1、LAG-3）的表达,q PCR检测PD-L1 m RNA表达情况。3、异种淋巴细胞混合反应检测DC刺激T细胞增殖和分化能力:将各组DC与异种小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养72～96h,CCK-8实验检测T细胞增殖情况,q PCR检测T细胞耗竭表型（TIM-3、Galectin-9、PD-1）m RNA表达情况,流式细胞术检测CD8+T细胞活化（Granzyme B、IFN-γ）、Treg细胞（CD4+CD25+Foxp3+）、T细胞耗竭（PD-1、TIM-3和BTLA）表达情况,q PCR检测Galectin-9、TIM-3、PD-1 m RNA表达。4、体内实验:C57/BL6小鼠皮下接种黑色素瘤B16-F10细胞,建立荷瘤小鼠模型。将动物随机分为:对照组、DC疫苗组、PX478组、DC疫苗联合PX478组。分别处理小鼠,记录小鼠肿瘤生长情况。接种第24天处死小鼠,分离肿瘤组织,称重。Western blot检测肿瘤组织HIF-1α表达,流式细胞术检测小鼠脾脏组织DC成熟表型（CD80、CD86、CD40和MHCII）、免疫抑制分子（LAG-3、PD-L1）、CD8+T细胞活化（Granzyme B+、IFN-γ+）Treg细胞（CD4+CD25+Foxp3+）、T细胞耗竭（PD-1、TIM-3和BTLA）表达情况,q PCR检测肿瘤组织PD-L1、Galectin-9 m RNA和脾脏组织TIM-3、PD-1 m RNA表达。结果:1、缺氧组DC HIF-1α的表达显著升高,HIF-1α抑制剂PX478能有效抑制HIF-1α的表达。缺氧组较常氧组GLUT1、HK2、PKM2、LDHA m RNA表达上升,并且缺氧处理的DC丙酮酸含量减少,乳酸含量、乳酸/丙酮酸比值、葡萄糖摄取量、ATP含量、乳酸脱氢酶活力升高,DC葡萄糖酵解增强,而使用PX478后DC葡萄糖酵解减弱。2、Transwell小室实验结果显示,缺氧组DC迁移的细胞数量较常氧组显著减少,q PCR检测结果表明缺氧组DC趋化因子受体CCR5表达上升,CCR7表达下降。流式细胞术结果显示缺氧组DC凋亡较其他组显著增多。缺氧组较常氧组DC中CD80+表达有下降趋势但无统计学意义,CD86+、CD40+、MHCII+表达下降,PD-L1+、LAG-3+表达上升,而使用PX478后DC成熟度恢复,免疫抑制分子表达减弱。3、混合淋巴细胞反应:CCK-8结果显示缺氧培养的DC对T淋巴细胞的增殖有负面影响但结果无统计学意义。流式细胞术检测结果显示,缺氧组较常氧组CD8+T细胞IFN-γ+、Granzyme B+表达降低,Treg细胞增多,CD4+T和CD8+T细胞中的BTLA+、TIM-3+、PD-1+表达上升,Galectin-9、TIM-3、PD-1 m RNA表达增强,PX478组T细胞耗竭被逆转,Treg细胞减少,T细胞活化增强。4、体内实验结果显示:使用PX478联合DC疫苗治疗小鼠后,肿瘤体积、重量减小,肿瘤组织HIF-1α和免疫抑制分子表达减弱,DC免疫调节能力增强,CD8+T细胞中IFN-γ+、Granzyme B+细胞增多,T细胞活化增强,Treg细胞数量下降,T耗竭状况得到改善,TIM-3、PD-1及其配体PD-L1 m RNA表达降低,Galectin-9 m RNA表达有下降趋势但无统计学意义。DC疫苗组与对照组相比,成熟表型CD86+、MHCII+表达升高,CD8+PD-1+T细胞表达下降,但联合组治疗效果优于DC疫苗组。结论:1、缺氧可通过促进DC中HIF-1α的表达促进DC葡萄糖酵解,抑制DC的成熟和迁移能力,促进DC凋亡和抑制分子的表达。2、高表达HIF-1α的DC可抑制细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤免疫应答,诱导Treg分化,促进T细胞耗竭。3、抑制HIF-1α可促进DC疫苗对小鼠黑色素瘤的免疫活性,增强细胞毒性T淋巴细胞的杀瘤活性,从而抑制肿瘤生长。