SEMA3B在老年性骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化中的生物学作用研究

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目的:观察SEMA3B对老年骨质疏松患者(SOP)人骨髓间充质干细胞(h-BMMSC)的成骨分化作用。方法:对股骨近端骨折的老年病人做QCT骨密度检测,依据结果将其分为两组(骨质疏松组和非骨质疏松组)。两组间各选10人行骨髓取样,采用全骨髓贴壁法做细胞培养,利用有限稀释法进行细胞提纯,使用流式细胞技术对获取的h-BMMSC进行细胞表观鉴定。采用CCK-8法检测两组h-BMMSC的增殖能力。利用碱性磷酸酶和茜素红染色观察两组h-BMMSC的成骨分化活性。进一步引入RT-PCR技术,检测两组h-BMMSC与SEMA3B表达水平的关系,并检测两组在成骨分化过程中(第3、7、10和14天)SEMA3B表达水平的变化情况。然后,运用慢病毒转染技术将SEMA3B过表达,观察h-BMMSC的增殖和成骨分化的情况。进一步细胞体外实验,分为空白组(h-BMMSC组)、对照组(h-BMMSC+慢病毒感染组)和实验组(h-BMMSC+慢病毒转染组),提取三组中SEMA3B m RNA,运用RT-PCR检测SEMA3B在h-BMMSC的表达水平,检测SEMA3B的转染效率。而后进行细胞培养,运用CCK-8法检测三组间h-BMMSC的增殖能力;使用碱性磷酸酶和茜素红染色法观察组间h-BMMSC的成骨分化活性;采用RT-PCR技术检测三组间成骨基因(Runx2、ALP、OCN)的表达水平。结果:(1)人骨髓组织经全骨髓贴壁细胞培养、有限稀释纯化后,可获得较同质化的原代h-BMMSC。流式细胞鉴定结果:超过90%获得的细胞对CD29、CD90和CD105表达阳性、而对CD34和CD45表达阴性。此结果与h-BMMSC细胞表观特性一致。(2)CCK-8实验结果:在前5天,骨质疏松组和非骨质疏松组h-BMMSC的增殖能力无差异;在第5天以后非骨质疏松组h-BMMSC增殖能力显著提高。(3)碱性磷酸酶试验结果:非骨质疏松组h-BMMSC在成骨分化过程中碱性磷酸酶的活性显著高于骨质疏松组。茜素红实验结果:h-BMMSC在成骨分化第21天时,非骨质疏松组的矿化能力强于骨质疏松组;非骨质疏松组的钙结节数量显著高于骨质疏松组。(4)RT-PCR检测SEMA3B的表达水平,非骨质疏松组h-BMMSC中SEMA3B的表达水平为骨质疏松组的1.27倍。骨质疏松组和非骨质疏松组h-BMMSC中SEMA3B的表达水平均随着成骨分化的时间的增加而增加;非骨质疏松组h-BMMSC在第3、7、10和14天SEMA3B的表达水平均高于骨质疏松组。(5)转染后运用RT-PCR检测SEMA3B在h-BMMSC的转染率,结果:空白组和对照组无差异,相对于对照组,实验组SEMA3B表达水平上升明显。(6)转染后CCK-8实验结果:在三组h-BMMSC细胞增殖中,空白组和对照组无差异;在前5天,对照组和实验组h-BMMSC的增殖能力无差异;在第5天以后实验组h-BMMSC增殖能力较对照组显著提高。(7)转染后碱性磷酸酶结果:在三组h-BMMSC细胞成骨分化过程中,空白组和对照组无差异;实验组h-BMMSC碱性磷酸酶活性显著高于对照组。(8)转染后茜素红实验结果:在三组h-BMMSC细胞成骨分化第21天时,空白组和对照组无差异;实验组h-BMMSC的矿化能力及钙结节数明显高于对照组。(9)转染后成骨相关基因表达结果:在三组h-BMMSC细胞成骨分化过程中,空白组和对照组无差异;与对照组相比,实验组h-BMMSC成骨标志基因的表达均升高。结论:老年性骨质疏松人群h-BMMSC的增殖能力、成骨分化活性和SEMA3B的表达均低于非骨质疏松人群。SEMA3B可明显促进老年性骨质疏松症人群h-BMMSC的细胞增殖和成骨分化。
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