天花粉蛋白通过miR-4672影响宫颈癌Hela细胞的增殖及迁移

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目的:本实验以宫颈癌Hela细胞为研究对象,分析天花粉蛋白(TCS)处理对Hela细胞内miRNA表达谱的影响。探索TCS上调miRNA4672的机制,以及miRNA4672高表达对宫颈癌细胞的影响。  方法:(1) TCS处理人宫颈癌细胞Hela后提取RNA用miRNA芯片分析检测其miRNA表达谱的改变;(2)实时定量PCR验证miR4672表达上调;(3)报告基因分析鉴定启动子活性;(4)甲基化测序技术鉴定TCS对miR4672启动子甲基化状态的影响;(5)细胞划痕实验检测高表达miR4672后对细胞迁徙能力的影响;(6)Western blot检测高表达miRNA4672对E-CAD表达的影响;(7)流式细胞术检测细胞周期的改变。  结果:(1)利用miRNA芯片技术筛选出天花粉蛋白处理宫颈癌Hela细胞前后差异表达的miRNA一共有25个,其中miRNA表达上调的有10个,表达下调的有15个;(2)实时荧光定量PCR验证miR4672表达上调,结果与芯片分析相符合。(3)报告基因分析发现,miR4672基因不存在独立启动子,它可能与宿主基因AK1共用一个启动子;(4)甲基化测序分析发现,TCS能降低AK1基因启动子区CpG岛的甲基化水平;(5)细胞划痕实验显示高表达miR4672能抑制Hela细胞的迁移;(6)FCM检测结果显示高表达miR4672后,更多的细胞出现在S期,而G0/G1期和G2/M期细胞明显减少;(7) Western blot检测发现,高表达miR4672使EMT相关的上皮标志蛋白E-CAD的表达明显上调。  结论:TCS处理人宫颈癌Hela细胞可改变miRNA表达谱,上调miRNA4672表达水平。TCS对miR4672宿主基因AK1启动子的去甲基化作用是TCS上调miRNA4672表达的可能机制之一。同时高表达miRNA4672对细胞的增殖、侵袭和EMT也起到了一定的抑制作用。本研究结果有助于进一步阐明TCS抗肿瘤药理学活性的分子机制,为进一步探索宫颈癌靶向治疗途径提供了实验依据。
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