灰树花多糖,特别是β-葡聚糖,被证实具有显著的抗肿瘤、降血糖和免疫调节活性。为获得高产量、高生物活性的β-葡聚糖,需系统地开展灰树花多糖合成途径挖掘及其调控策略的研究。本课题组前期已较为系统地优化了灰树花深层发酵工艺、解析了菌丝体多糖/胞外葡聚糖结构和功能,并建立了基于非完全酶解的原生质体制备和PEG介导转化等技术,在此基础上研究了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（gfugp）和葡聚糖合成酶（gfgls）等对灰树花菌丝体生长和菌丝体多糖/胞外葡聚糖合成过程中的角色。然而,灰树花胞外葡聚糖的分支糖链如何形成、哪些酶涉及葡聚糖的分支化等问题还未得到明确的回答。因此,本论文在课题组前期的基础上,首次挖掘、克隆得到可能涉及葡聚糖分支形成的葡聚糖基转移酶gfgel4基因,对其进行较为全面的生物信息学分析;进而通过前期构建的灰树花双元启动子基因沉默与过表达体系,构建gfgel4基因的沉默与过表达菌株,观察其在PDA上生长性状;最后考察gfgel4基因沉默与过表达对灰树花菌丝球形成、发酵性能、胞外葡聚糖分支化结构等影响,以期阐明gfgel4基因在灰树花菌丝体生长和胞外葡聚糖合成过程中的主要功能与作用。（1）克隆测序得到gfgel4基因（Gen Bank登录号:A0H81＿00473）全长序列。其g DNA序列全长1945 bp,c DNA序列全长1665 bp,含有5个内含子与6个外显子,共编码554个氨基酸,理论分子质量为57.127 k Da。蛋白结构域分析表明,gfgel4p氨基酸残基1-23存在一个信号肽,属于分泌蛋白,含有两个完整的结构域GH72催化结构域与X8结构域,无跨膜结构域。结合系统发育树与蛋白质结构信息可知gfgel4p属于GH72+亚家族,与Trametes coccinea和Ganoderma boninense的相似度分别达到74.9%和71.88%。（2）构建了gfgel4基因的沉默与过表达菌株。构建沉默质粒p AN7-gfgel4-dual与过表达质粒p AN7-35s-gfgel4、p AN7-gpd-gfgel4,PEG介导转化法转入灰树花原生质体中,筛选得到了沉默菌株GFGEL4-i-4、GFGEL4-i-6,过表达菌株GFGEL4-gpd-2、GFGEL4-gpd-3和GFGEL4-35s-2、GFGEL4-35s-4;相较于出发菌株的平均生长速度4.33±0.13 mm/d,GFGEL4-i沉默菌株生长速度下降了5.7%,GFGEL4-gpd与GFGEL4-35s过表达菌株生长速度分别上升了6.8%和2.4%;超景深显微镜与激光共聚焦显微镜观察发现GFGEL4-i沉默菌株的菌丝分布稀疏,与平板贴合紧密;GFGEL4-gpd、GFGEL4-35s过表达菌株呈多层致密状,且菌丝分叉数目也明显增多,菌丝较为粗壮。由刚果红染色激光共聚焦显微镜观察发现GFGEL4-gpd与GFGEL4-35s菌株的菌丝成熟处细胞壁厚度要高于GFGEL4-i菌株。（3）考察了gfgel4基因沉默与过表达对灰树花菌丝球形成、发酵性能、胞外葡聚糖分支化结构等影响。经7 d发酵后,相较于WT,GFGEL4-i的菌球直径显著下降了21.8%,发酵性能有不同程度的下降;GFGEL4-gpd与GFGEL4-35s则表现出较高的发酵性能,GFGEL4-gpd的菌球直径增加了19%,其中GFGE L4-gpd-2的生物量提高最多,达到22.1 g/L。单糖组成表明GFGEL4-i的菌丝体多糖和胞外多糖组分中葡萄糖含量分别下降了1.09%-1.65%和5.51%-9.94%;G FGEL4-gpd与GFGEL4-35s的菌丝体多糖和胞外多糖中葡萄糖含量分别增加了2.28%-4.37%和4.57%-8.05%,其中gfgel4基因转录水平最高的GFGEL4-gpd-3菌株所对应的胞外葡萄糖含量增加幅度最大,达到8.05%。另外,据甲基化结果表明沉默菌株中β-1,3-连接的葡萄糖残基比例增加,而过表达菌株中β-1,3-连接的葡萄糖残基比例则相应减少,末端葡萄糖和在分支点→3,6-Glcp-1→的残基比例略有增加,表明被基因沉默的菌株其分支度明显有所下降,而过表达菌株的分支度则高于出发菌株,且随着gfgel4基因转录水平的变化,其胞外葡聚糖的分支度也随之改变,并呈正相关的关系。q RT-PCR结果显示,GFGEL4-i中葡聚糖合成途径中主要的酶系gfugp、gfgls和gfgel4的转录水平均有不同程度的下降;过表达菌株（特别是GFGEL4-gpd）中,各关键酶的基因转录水平均有显著提高。据此推测,gfgel4沉默或过表达显著影响了gfugp与gfgls的转录水平,进而影响葡聚糖的产量,同时,gfgel4过表达有利于其胞外葡聚糖分支结构的形成。