本论文重点研究了荧光辐射差分显微术(fluorescence emission difference microscopy,FED)的相关理论,这种超分辨显微术是在共聚焦显微术的基础上,利用实心光斑和空心光斑扫描得到的两幅不同调制的共聚焦图像进行差分,实现超分辨成像。我们提出使用简单的环形光瞳滤波器提高荧光辐射差分成像显微术的成像分辨率。在空心焦斑光路上使用合适的环形光瞳滤波器,压缩空心焦斑的尺寸。同时,在实心焦斑的光路上允许使用更高数值孔径的孔径光阑,获得更小的实心光斑分布与之相匹配。两方面作用下,提高了荧光辐射差分显微术的空间分辨率,将分辨率提高到超越衍射极限的0.18λ(λ是激发波长),成像分辨能力提高了14.3%。由于方位角偏振(azimuthal polarization)光束能产生更小的空心焦斑,本文将其应用于FED中,并采用了一种三区振幅型光瞳滤波器,即漏光型光瞳滤波器,进一步缩小方位角偏振环形光的空心光斑的空洞尺寸。通过设计合适的滤波器参数,将FED分辨率进一步提高到0.17λ,相较于不加光瞳时的方位角偏振的荧光辐射差分显微术,分辨能力提高了8.6%。研究表明,使用合适的光瞳滤波器能够改善FED的成像分辨率,能为FED的实际应用提供一定的指导。荧光差分显微成像技术是基于激光扫描共聚焦成像平台发展起来的一种超分辨成像技术。本论文对共聚焦激光扫描显微系统的研制开展了实验研究,利用点照明和探测针孔共轭的方式,极大的消除了离焦平面的杂散信号,通过层析扫描的方式实现了三维显微成像。共聚焦显微术因其能对活细胞进行高分辨的三维成像特点,被广泛的应用于生物医学等领域。本课题调研了共聚焦显微术的基本原理和发展现状,搭建了激发光路、探测光路、扫描探测光路等模块,构建了一套完整的激光扫描共聚焦成像系统。利用自主编写的控制软件成功的进行了多种样品的二维成像实验,以及三维层析成像,横向成像分辨率可以达到448nm左右。