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为了研究玉米幼苗根尖适应低氧胁迫的能力和适应的代谢分子机理即相关蛋白的表达,本实验采用双向电泳技术(2-DE)结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS),直接从差异表达的蛋白质来探讨玉米幼苗根尖细胞响应和适应低氧逆境胁迫的生理和代谢分子机理。在实验中,我们用PDQuest 6.0和Image Master 2D Elite 3.10图像分析软件分析了正常氧浓度和低氧浓度胁迫时的玉米幼苗根尖细胞表达蛋白的全蛋白组分的2-DE凝胶图像,同时用GS-170光密度仪扫描2-DE凝胶,根据不同蛋白点的光密度值对这些蛋白点进行了定量分析。对获得的侯选蛋白点,用肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting,PMF)鉴定蛋白技术,在Mascot和MS-Fit分析处理软件系统的帮助下,通过因特网方式访问,利用获得的肽质量质谱数据检索蛋白质和核酸序列数据库,分析并鉴定了低氧胁迫时2-DE凝胶上的这些侯选蛋白点。 在鉴定了的46个蛋白点中,有26个蛋白点13种蛋白在玉米蛋白质和核酸序列数据库中可以找到,这些蛋白酶类参与了玉米幼苗根尖细胞糖酵解、乙醇发酵和氮代谢。它们是:乙醇脱氢酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇化酶、肌动蛋白、β-D-葡糖甘酶、ATPase、二磷酸甘油醛变构酶、谷氨酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、热激蛋白、转录起始因子、线粒体分子伴侣、高尔基体复合蛋白。并且,参与糖酵解和乙醇发酵的乙醇脱氢酶表达量增加达5倍,丙酮酸脱羧酶的表达量增加了3倍多,三磷酸甘油醛脱氢酶表达量增加了1倍左右,其它参与糖代谢和能量代谢的蛋白酶类却受到了不同程度的抑制。但是,与玉米低氧逆境条件下糖酵解和乙醇发酵途径有重要作用的丙酮酸脱羧酶鉴定结果却是与水稻丙酮酸脱羧酶蛋白的序列同源。并且,在这13种蛋白中,部分蛋白在2-DE凝胶上对应的不止一个蛋白点,即有同型蛋白(isoform protein)出现。 其余20个蛋白点11种蛋白与水稻、紫苜蓿、烟草、拟南芥、大麦、长春花、大豆、欧洲油菜和甜菜9种不同植物的蛋白是序列同源,它们也是参与糖和氮代谢的蛋白酶类。这20个蛋白点11种蛋白是:丙酮酸脱羧酶、苹果酸脱氢酶前体、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸酶、天冬氨酸转氨酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、甲硫氨酸合成酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、延长因子、苹果酸脱氢酶、线粒体延长因子。这11种蛋白也有部分蛋白是同型蛋白。 在这些鉴定了的与玉米幼苗根尖在低氧逆境胁迫下通过相关基因表达产生的代谢调节酶蛋白中,我们对部分重要蛋白诸如肌动蛋自、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、热激蛋白、磷酸甘一油异构酶和A’l、山、。复合物等重要功能活性蛋白作了分析和讨论。得到最重要的结论是:在氧逆境胁迫时,玉米幼苗根尖细胞肌动蛋白表达并且表达量增加了近2倍,更山于肌动蛋白具有ATPase活性,这可能是逆境胁迫下适应生理和代谢变化的调控结果。肌动蛋白表达量的上调有可能是本实验的一个新发现:肌动蛋白也是一种逆境蛋白(streSSpr’otein),但需要实验进一步验证;蛋白鉴定结果表明以二维电泳(2一DE)和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术(MALDI一TOF一MS)为技术支撑的肤质量指纹谱鉴定植物蛋白技术是切实可行的方法,可以弥补因蛋白的微不均一性和蛋白N一端封闭造成的不能用Edman测序法鉴定蛋白的不足;对来源于玉米根尖组织蛋白鉴定结果却是与其它植物种属蛋白序列同源现象,我们作了6种可能原因的分析:对鉴定结果中的同型蛋白(i soform protein),我们从材料的遗传背景和基因的表达两个方面作了探讨;在文中,我们还展望了逆境胁迫诱导相关蛋白表达的研究在作物遗传育种中抗逆境胁迫育种的实践指导意义。