【摘 要】
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鲂鲌“先锋2号”是由团头鲂(Megalobrama amblycephala,♀)和黑尾近红鲌(Ancherythroculter nigrocauda,♂)经过杂交后多代定向选育而成的新品种,具有生长快、抗病力强及耐运输等的特性,是我国重要的特色经济鱼类。通过长期养殖发现,“先锋2号”的雌性比雄性具有更快的生长速度,其全雌鱼培育将会带来更高的市场经济价值。同时可在短时间内积累该品种的优良性状,且
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鲂鲌“先锋2号”是由团头鲂(Megalobrama amblycephala,♀)和黑尾近红鲌(Ancherythroculter nigrocauda,♂)经过杂交后多代定向选育而成的新品种,具有生长快、抗病力强及耐运输等的特性,是我国重要的特色经济鱼类。通过长期养殖发现,“先锋2号”的雌性比雄性具有更快的生长速度,其全雌鱼培育将会带来更高的市场经济价值。同时可在短时间内积累该品种的优良性状,且避免其对自然资源造成基因污染。性别分子标记的开发对于单性育种和规模化定向养殖至关重要,但目前并没有关于该杂交种的性别分子标记开发的相关研究。本研究通过将2b-RAD简化基因组测序和转录组测序联合分析,挖掘该杂交种性别特异性分子标记。利用2b-RAD技术挖掘得到9个候选雄性特异性分子标记;然后将候选雄性特异分子标记在杂交种及黑尾近红鲌群体中进行验证,同时结合杂交种雌雄性腺转录组比较数据分析,获得2个雄性特异分子标记(其中包含1个基因编码区的分子标记),从基因组及转录组表达谱水平开发了该杂交种的雄性特异性分子标记;并将其应用于杂交种雌核发育全雌群体F1及经过不同浓度的雄激素诱导产生的伪雄鱼的性别鉴定,通过诱导成功率确定最佳雄激素处理浓度,为该杂交种全雌群体规模化养殖奠定基础。论文主要研究结果如下:(1)鲂鲌“先锋2号”性别特异性分子标记的筛选选取20尾鲂鲌“先锋2号”个体(10雌和10雄),进行2b-RAD简化基因组测序分析,从基因组DNA水平挖掘到(ref-57033-1,ref-57660-1,ref-85149-1,ref-106035-1,ref-119563-1,ref-206431-1,ref-231141-1 ref-305044-1,ref-330456-1)9个候选雄性特异性分子标记;将候选雄性特异性分子标记分别在20尾2b-RAD测序样本群体中进行PCR验证;结果发现ref57033-1和ref57660-1均只在雄性个体中存在,雌性个体中均不存在,经过验证初步得到了2个有效的雄性特异性分子标记;之后扩大样本,将这2个分子标记在30尾鲂鲌杂交种雌雄个体及30尾黑尾近红鲌雌雄个体中进行PCR验证。结果发现,所有雌性个体中均没有条带扩增,雄性个体均存在单一明亮条带;均能够准确区分雌雄,进一步验证了这2个分子标记的普适性。(2)鲂鲌“先锋2号”雌雄性腺转录组比较及性别特异性分子标记表达验证将成熟的鲂鲌“先锋2号”的性腺组织进行雌雄比较转录组测序分析,雄性组共鉴定出21,324个DEGs,与雌性组相比,雄性组上调15,299个DEGs,下调6,025个DEGs。其中有3,122个DEGs仅在雄性中表达,而在雌性中不表达;通过2b-RAD简化基因组测序与转录组测序联合分析,将筛选到的2个雄性特异性分子标记与DEGs进行比对,结果发现ref57660-1(326 bp)与Trinity DN17103(770 bp)成功匹配,且仅在雄性中表达,之后设计半定量实验进一步验证了其结果的准确性;再通过NCBI数据库进行同源性比对,结果发现Trinity DN17103(770 bp)与杂交种父本黑尾近红鲌的一个微卫星位点(EHWB15)存在80%同源性,进一步从基因表达水平验证了该雄性特异性分子标记的可靠性。(3)雄性特异性分子标记在“先锋2号”雌核发育群体性逆转研究中的应用采用灭活的兴国红鲤精子刺激鲂鲌“先锋2号”卵子,通过冷休克抑制第二极体释放获得鲂鲌“先锋2号”雌核发育群体,性腺发育检测均为雌性;用兴国红鲤的微卫星标记进行遗传学验证,发现雌核发育群体没有父系遗传物质的渗透,从而推测鲂鲌“先锋2号”的性别决定机制为XX-XY型。进一步基于雌核发育群体开展性逆转研究,在鱼苗孵出后30天到150天,投喂含不同浓度(0 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg)甲基睾丸酮雄激素饲料;结合雄性特异性分子标记和性腺组织切片,对不同浓度梯度甲基睾丸酮处理的雌核发育个体进行性别鉴定。结果显示,100 mg/kg雄激素处理组的雄性诱导率为30%;200 mg/kg雄激素处理组雄性诱导率为45%。从生理学和遗传学角度准确鉴定出伪雄鱼,为其全雌群体的培育奠定了基础。
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