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第一部分环境嗜肺军团菌在小鼠巨噬细胞内的生长特征[目的]嗜肺军团菌是一种胞内生长菌,可引起爆发性、致死性肺炎,水体环境中定植的嗜肺军团菌是人军团菌病的主要感染源。本研究采用医院供水系统中分离的菌株,研究环境嗜肺军团菌(Environmental Legionella pneumophila, LPE)在宿主巨噬细胞内的生长特征及机制。[方法]以临床分离的嗜肺军团菌费城株的衍生菌株JR32作为对照菌株,通过细菌定量培养观察LPE在A/J小鼠骨髓巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage from A/J mouse, BMDMA/J)人巨噬细胞U937和阿米巴宿主盘基网柄菌胞内的生长情况。随后通过对LPE509中Dot/Icm IVB型分泌系统(Type IVB Secretion System, T4BSS)的组成和p-内酰胺酶转位实验检测LPE509运输效应蛋白至宿主胞浆的功能。最后通过对宿主蛋白Rab1, LAMP-1和细菌囊泡的荧光染色研究感染早期宿主蛋白对LPE509囊泡的锚定及其在胞内的发展。[结果](1)LPE509在人巨噬细胞U937和盘基网柄菌内可有效生长,但在BMDMA/J内的生长受限。敲除dotA基因可限制LPE509在U937细胞中的生长,但不影响其在BMDMA/J中的生长。(2)基因测序显示结果LPE509具有由27个基因组成的完整的T4BSS;β-内酰胺酶转位实验显示LPE509对效应蛋白的转运功能与JR32相似(Ipgl171:76.3±3.9%vs70.5±7.8, P>0.05; lpg0796:56.9±4.9%vs60±6.0%, P>0.05)。(3)荧光染色显示LPE509感染小鼠巨噬细胞后1h,2h和6h对宿主蛋白LAMP-1和Rabl的招募作用与JR32相比无明显差别(P>0.05)。(4) LPE509感染BMDMA/J后14h,发展为大型囊泡的比率显著小于JR32(18.2±2.0%vs66.0±5.2%, P<0.001)。(5) LPE509感染BMDMA/J后14h盖玻片上细胞数量较感染前显著减少,其比率大于由JR32感染引起的细胞数量减少(44.9±14.5%vs9.4±16.3%, P<0.05)。(6) LPE509感染BMDMA/J后5h,囊泡破坏比率显著高于JR32感染后囊泡破坏的比率(60.0±11.7%vs15.5±0.06%,P<0.001)。[结论]与既往研究的临床嗜肺军团菌不同,LPE509具有宿主特异性的生长限制。其机制可能与宿主细胞对细菌囊泡的破坏及LPE509感染引起的造成宿主细胞的急剧减少有关。第二部分环境嗜肺军团菌感染导致小鼠巨噬细胞焦亡及其机制[目的]研究环境嗜肺军团菌在小鼠巨噬细胞胞内生长受限原因及可能的机制。[方法]本研究以JR32作为对照菌株,通过Hoechst/PI双核酸染色技术,LDH释放实验和TUNEL染色确定LPE509感染BMDMA/J后发生的细胞死亡形式,并通过对感染细胞上清液中]HMGB1和IL-1p的检测了解在细胞死亡过程中伴随的炎症因子释放。随后使用敲除flaA基因的LPE509感染小鼠巨噬细胞并检测由此引起的细胞死亡以确定细菌鞭毛蛋白在导致细胞死亡中的作用。通过对caspase-1/11-/-小鼠巨噬细胞感染实验确定caspase1和caspase11在LPE509导致的细胞死亡中的作用。最后,使用EMS随机突变方法筛选出一个LPE509的突变子,并初步确定了可能影响LPE509胞内生长的细菌毒力因子。[结果](1)LPE509感染导致的细胞PI染色阳性率,LDH释放及TUNEL染色阳性率均显著高于JR32(PI:44.2±2.0%vs5.0±1.4%, P<0.001; LDH:2h16.3±2.7%vs1.1±1.0%, P<0.001,4h34.2±5.3%vs12.9±1.3%, P<0.01; TUNEL:42.4±4.8%vs17.9±1.3%, P<0.01).(2) LPE509感染小鼠巨噬细胞后可引起HMGB1和IL-1p的释放,而LPE509△dotA感染后未检测到HMGB1和IL-1p的释放。(3)LPE509△flaA菌株感染A/J小鼠和C57BL/6小鼠巨噬细胞后均不能在胞内生长,并且感染后细胞PI染色阳性和TUNEL染色阳性率仍显著高于JR32(PI:37.2±5.2%vs5.0±1.4%, P<0.001; TUNEL:38.2±2.8%vs17.9±1.3%, P<0.001)。(4) LPE509和LPE509A△flαA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬细胞后仍不能在胞内生长,且LPE509△/flα4感染后导致的LDH释放显著高于(63.4±5.1%vs12.5±1.9%, P<0.001)。 LPE509和LPE509△flαA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬细胞后所引起的IL-1p释放较感染C57BL/6小鼠的IL-1β释放减少。(5)使用EMS随机突变,我们筛选到一株LPE509突变子可在BMDUA/J进行增殖。基因组测序比对后发现了在蛋白编码基因lvrA, lpg1594, Ipg1975, sdeC, legA3和luxN的碱基突变或移码突变。[结论]LPE509在感染小鼠巨噬细胞后,可导致快速而强烈的炎症性细胞死亡(细胞焦亡),从而限制其在A/J小鼠巨噬细胞中的增殖。不同于之前的发现,由此菌株所导致的细胞焦亡不依赖于caspase-1和caspase-11的激活。