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线粒体是高度动态变化的细胞器,其在细胞内通过不断的融合与分裂以保持一定的形态。线粒体的分裂与融合程度失衡,会引起线粒体功能障碍,如线粒体膜去极化及ATP合成受抑制等,机体主要通过线粒体自噬来消除这些发生功能障碍的线粒体。线粒体自噬是自噬机制对线粒体的一种选择性的清除,即损伤的线粒体被包裹在自噬体中,进而与溶酶体融合而被降解,以此来保证细胞的稳态。线粒体自噬的异常与多种疾病包括神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等都密切相关。我们先前的研究发现,重组型荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI(recombination buckwheat trypsin inhibitor)主要通过诱导肿瘤细胞自噬来抑制细胞增殖的,但是rBTI诱导肿瘤细胞发生自噬的机制还不清楚。近期研究显示,rBTI作用于肝癌细胞Hep G2后,线粒体数量明显减少,且伴随有大量自噬泡的产生,由此推测rBTI诱导Hep G2细胞发生的自噬可能为线粒体自噬。为了进一步研究rBTI诱导Hep G2细胞发生自噬的机制,本实验采用透射电子显微镜、MDC染色、Western Blot、质粒pEGFP-LC3转染细胞及激光共聚焦显微镜等方法分析rBTI对HepG2细胞自噬水平的影响;质粒pDsRed2-mito转染细胞、激光共聚焦显微镜等技术分析rBTI对线粒体形态的影响;Western Blot及qRT-PCR技术分析rBTI对线粒体融合与分裂的影响;质粒pEGFP-LC3与pDsRed2-mito共转染Hep G2细胞来分析自噬标志蛋白LC3与线粒体的共定位;流式细胞术、酶标仪、Western Blot等技术分析rBTI对Hep G2细胞线粒体膜电位、ROS及抗氧化系统的影响;流式细胞术、pEGFP-LC3转染细胞及Western Blot分析ROS和rBTI诱导的自噬的关系。结果显示,rBTI作用于Hep G2细胞后,包裹有线粒体的自噬体结构明显增多;细胞的自噬水平升高;点状分布的GFP-LC3增多;细胞自噬相关分子(LC3,beclin1,ATG5)表达量升高,自噬底物P62表达降低,表明rBTI诱导Hep G2细胞发生自噬。同时发现,线粒体标志分子Tom20和CoxⅣ表达水平降低,线粒体发生片段化,线粒体分裂蛋白Fis1表达水平升高,而线粒体融蛋白Mfn1表达水平降低,表明rBTI促进线粒体发生分裂,引起线粒体数量减少。因此推测rBTI促进自噬机制对线粒体的清除。而且发现,自噬标志蛋白LC3与线粒体的共定位现象增强,进一步说明rBTI诱导Hep G2细胞发生的自噬属于线粒体自噬。同时检测到,rBTI引起线粒体膜电位降低,诱导活性氧(ROS)短暂升高,ATP水平降低,表明rBTI引起Hep G2细胞线粒体发生功能障碍,这可能是rBTI引起Hep G2细胞发生线粒体自噬的直接原因。而超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性,还原型谷胱甘肽(GSH)的含量及还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例均有升高的趋势,表明rBTI增强了细胞的抗氧化能力,这可能是细胞对ROS短暂升高的应激反应。同时发现,ROS又可以作为一种信号分子参与rBTI诱导的线粒体自噬。这些结果为深入研究rBTI诱导肿瘤细胞线粒体自噬的机制提供了重要的基础和实验依据。