酚氧化酶是黑化反应的关键酶,其激活依赖于级联反应的丝氨酸蛋白酶途径。丝氨酸蛋白酶在体内以酶原的形式存在,当病原物入侵且被信号识别时,一系列丝氨酸蛋白酶被级联激活,最终导致酚氧化酶原激活蛋白酶（PAP）被激活,进而切割激活酚氧化酶原（PPO）产生有活性的酚氧化酶（PO）,导致黑色素的形成,发生黑化反应,黑化反应在昆虫中是一种普遍存在的防御机制。本实验从小菜蛾血浆的PULL-DOWN实验结果中分析筛选出三个黑化相关基因PAPs（分别命名为PAP1,PAP3,PAP3a）。本文利用分子生物学手段,研究了它们在黑化反应中的功能和作用机制,以及与mi RNA调控的关系,得到了以下研究结果:序列分析表明,PAP1和PAP3a包含一个单一的剪切域（clip domain）,而PAP3的氨基末端包含两个剪切域,羧基末端则是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化结构域。多序列比对结果表明,PAP1、PAP3、PAP3a编码的氨基酸序与其他鳞翅目昆虫（棉铃虫、烟草天蛾、家蚕等）的PAP聚为一支,具有较高的相似性,同源关系较近。利用RT-qPCR技术对小菜蛾PAP1、PAP3和PAP3a的时空表达模式以及微生物诱导后的表达模式进行检测。结果表明:（1）PAP1基因在体壁和血细胞中高表达,PAP3、PAP3a基因在血细胞中高表达,其余组织表达量较低;（2）PAP1基因在小菜蛾预蛹和四龄幼虫期表达量较高,PAP3基因在小菜蛾雌蛹和四龄幼虫期表达量较高,PAP3a基因在小菜蛾雄成虫期表达量最高,四龄幼虫期次之,基因的表达量会随着幼虫的发育而波动;（3）经苏云芽孢杆菌和绿僵菌侵染后,在小菜蛾不同中肠和脂肪体组织中均可以诱导PAP1、PAP3和PAP3a的表达,表明PAPs参与小菜蛾的免疫反应,在抵御病原物的入侵中发挥重要作用。从苏云芽孢杆菌（HD73）和绿僵菌处理后小菜蛾mi RNA测序结果中预测得到10个与PAP1具有靶标对应关系的mi RNA,5个与PAP3具有靶标对应关系的mi RNA,4个与PAP3a具有靶标对应关系的mi RNA,为了进一步确定其调控关系,最终选择靶标基因PAP1所对应的9个mi RNA进行验证,并构建了PAP1的双荧光载体。为进一步阐述小菜蛾PAPs的功能,本实验成功构建原核表达质粒,纯化得到融合蛋白,并成功制备多克隆抗体anti-PAP1、anti-PAP3,对其检测,anti-PAP1和anti-PAP3的滴定效价为1:12800。为了验证蛋白的结构与功能,本研究将PAP1、PAP3、PAP3a的激活位点（NGDR、QGNR、GSDR）突变成商业化蛋白酶Factor Xa识别切割IEGR。SDS-PAGE检测,PAP1Xa分子量为57.3 KDa的酶原带减少,并出现一条分子量为29.4 KDa的带,并获得了可在体外被激活的PAP1、PAP3、PAP3a蛋白。本论文从小菜蛾血浆的PULL-DOWN实验结果中筛选出了3个黑化相关基因PAPs,明确了靶标基因与mi RNA的调控关系,初步阐明了PAPs参与了小菜蛾的免疫反应,明确了PAPs在丝氨酸蛋白酶级联反应中发挥的重要作用以及在黑化反应中的作用机制,为阐明小菜蛾免疫系统提供了分子依据,也为利用昆虫免疫系统进行生物防治提供了理论依据。