紧密连接主要骨架蛋白Claudin-6(CLDN6)表达具有高度的器官组织特异性,过表达CLDN6能够引起乳腺癌细胞增殖抑制、诱导细胞凋亡,提示CLDN6可能是一种抑制基因,有可能成为乳腺癌预测和诊治的一种标记物。CLDN6是一种膜蛋白,可能参与细胞自噬,在前期高通量筛选CLDN6调控靶基因工作中,发现自噬相关基因表达上调。同时,过表达CLDN6时,乳腺癌细胞MCF-7线粒体肿胀、内质网扩张,提示自噬在CLDN6抑制乳腺癌细胞恶性表型中发挥作用,这可能与自噬在肿瘤发生中的作用有关。对CLDN6结构、亚细胞定位及其相关信号进行预测和分析,有助于研究CLDN6参与的细胞生物学行为。本研究首先分析不同分子亚型乳腺癌患者CLDN6表达与临床病理特征相关性及对预后的影响,探讨CLDN6在导管型乳腺癌中表达的临床意义,评价其临床预后价值。其次,分析CLDN6基因调控区、蛋白结构、亚细胞定位及其调控网络,分析CLDN6与细胞自噬的关系。最后,探讨过表达CLDN6是否诱导细胞自噬,自噬对过表达CLDN6细胞的影响及可能机制。以上研究将丰富CLDN6蛋白的基础信息、为乳腺癌早期诊断、预后判定及治疗提供潜在的一种标靶。方法:1.不同分子亚型乳腺癌组织中CLDN6表达与临床病理特征及预后的关系(1)利用TCGA和UALCAN线上数据库,整理乳腺癌数据,分析乳腺癌CLDN6表达水平与不同类型乳腺癌患者临床病理学参数的相关性、对患者预后的影响。(2)采用RT-PCR和Western blot方法检测HBL-100细胞和乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中CLDN6 m RNA和蛋白表达情况;采用免疫组织化学方法检测160例乳腺癌组织芯片中CLDN6蛋白的表达与定位,分析CLDN6在不同类型乳腺癌中的表达及对预后的影响。2.CLDN6基因调控区和蛋白结构生物学信息(1)利用BLAST比对获取人CLDN6基因5’调控区序列,利用在线分析平台软件神经网络启动子预测软件和PROMOTER 2.0分析启动子、EMBOSS和Cp G Island Searcher分析Cp G岛的位置,TFSEARCH分析潜在的转录因子结合位点。(2)利用Inter Pro分析蛋白功能;应用WOLFPsort和PSORT II网站预测蛋白在真核细胞的亚细胞位置;采用KEGG数据库平台,富集分析CLDN6相关蛋白及其信号通路、功能。3.CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的作用3.1 CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬(1)稳定表达CLDN6乳腺癌细胞克隆的鉴定:利用前期构建的CLDN6真核表达载体,转染至乳腺癌MCF-7细胞,用G418筛选出过表达CLDN6的MCF-7单细胞克隆。利用RT-PCR和Western blot分别检测空载(vector)组和克隆(clone)组细胞CLDN6表达水平;通过荧光显微镜观察CLDN6定位和表达。(2)稳定表达CLDN6乳腺癌细胞自噬水平的判定:细胞分为vector和clone两组,用透射电镜观察细胞内自噬体结构,用体视学测量法分析自噬体细胞的自噬体截面参数;用免疫荧光染色法观察LC3II定位和表达;用吖啶橙染色法观察细胞内嗜酸性囊泡着色情况;用Western blot检测自噬相关蛋白LC3II、beclin1和P62的表达。3.2自噬对CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响3-MA对稳定表达CLDN6的MCF-7细胞凋亡的影响:细胞分为vector、clone和3-MA(5 mmol/L,4 h)组。用免疫荧光、Hoechst33342和流式细胞术和透射电镜技术分别观察抑制自噬细胞凋亡情况。3.3 CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的作用机制采用Western blot方法检测p38/CHOP信号通路中的相关蛋白p38、CHOP、Bcl-2的表达。用p38抑制剂SB203580处理clone细胞后,进一步检测通路蛋白的表达及对自噬相关蛋白LC3II和beclin1表达的影响。结果:1.不同分子亚型乳腺癌组织中CLDN6表达与临床病理特征及预后的关系(1)TCGA数据结果显示:CLDN6表达水平与患者的绝经情况和乳腺癌类型相关;与正常乳腺组织相比,HER2过表达、TNBC型及Luminal型乳腺癌中CLDN6表达水平均较高(P<0.05),Luminal型乳腺癌组织中CLDN6表达水平低于HER2型和TNBC型中的表达水平,TNBC-LAR型中的表达水平明显低于TNBC其他类型组。预后分析结果显示,CLDN6低表达与绝经后乳腺癌患者生存率降低(P<0.05),TNBC型中CLDN6低表达水平患者生存率低(P<0.05)。(2)RT-PCR和Western blot检测结果显示:与乳腺癌细胞株HBL-100比较,MCF-7中CLDN6 m RNA和蛋白表达水平均低表达(P<0.05);160例乳腺癌组织芯片中CLDN6蛋白主要定位在细胞质或细胞核,低表达占71.6%,高表达占28.4%,较癌旁组织表达水平低下(P<0.05)。CLDN6的低表达率在Luminal型乳腺癌占81.9%,Luminal型占45.6%,HER2过表达型占75%,TNBC型占16.9%,Luminal型乳腺癌低表达率较高,TNBC型中CLDN6表达水平有统计学差异(P<0.05)。2.CLDN6基因调控区和蛋白结构生物学信息(1)CLDN6基因调控区域有3个GC盒(SP1识别模序),但没有TATA和CAAT盒,CLDN6的表达和转录活性受SP1调控。CLDN6调控区序列有5个启动子,3个Cp G岛,TFSEARCH软件对转录因子结合位点预测评分100分时,有24个潜在的TFBSs,包括SPR、AML-1a、Cdx A、CRE-BP和CREB。(2)CLDN6由20个不同氨基酸组成220bp氨基酸序列,包括Ala(10.90%)、Gly(9.50%)、Leu(14.50%)、Ser(8.20%)和Val(10.90%),分子式是C1054H1682N268O291S16,分子量是23.2775k Da,理论等电点是8.32,半衰期大约是30 h,酸性残基比率低于碱性残基比率,CLDN6有104个α-螺旋(47.27%),48个延伸链(21.82%),14个β-转角(6.36%)和54个(24.55%)无规则卷曲及基序,折叠结构主要位于不同序列区。(3)CLDN6有一个由21个氨基酸残基组成的短信号肽,Talp P1.1预测CLDN6位于分泌蛋白途径(98.7%),Wo LF PSORT预测CLDN6是一种多通道细胞膜蛋白,参与紧密连接结构组成,PSORT II预测表明CLDN6可能定位于内质网(66.7%)和线粒体(33.3%)。(4)根据STRONGLY优选模型CLDN6具有四个强的跨膜螺旋,KEGG分析CLDN6与四个信号通路HSA04514;HSA045;HSA04670;HSA05160(p38/CHOP)有关。3.CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的作用3.1 CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬(1)稳定表达CLDN6乳腺癌细胞克隆的鉴定:RT-PCR、Western blot方法检测细胞克隆CLDN6表达。结果显示,与vector组比较,clone组细胞CLDN6表达水平上调(P<0.05);荧光显微镜观察clone组细胞CLDN6定位在细胞膜,且表达水平强度高于vector组。(2)稳定表达CLDN6乳腺癌细胞自噬水平的判定:利用透射电镜观察细胞,可见clone组细胞内出现典型的自噬体和凋亡小体,线粒体肿胀,相邻细胞间形成TJ结构;用体视学测量法测得自噬体细胞的自噬泡总截面面积较线粒体面积小;吖啶橙染色发现clone组细胞内橙红色的嗜酸性囊泡增多;免疫荧光染色法观察到clone组细胞质内出现多个红色LC3B聚集的荧光斑点。Western blot检测结果显示,与vector组比较,clone组细胞中LC3II/LC3I比值显著上调,beclin1表达水平上调,而P62表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.2自噬对CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响3-MA对稳定表达CLDN6的MCF-7细胞凋亡的影响:clone组细胞活力与vector组比较显著下降(P<0.05),加入3-MA组OD值上升;3-MA处理clone组细胞后,LC3B聚集的红色荧光较clone组明显下降;显著减少Hoechst33342染色中死亡细胞数,细胞凋亡率降低。3.3 CLDN6诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬的作用机制Western blot检测结果显示,clone组细胞中p38/CHOP信号通路相关蛋白p38、CHOP、Bcl-2的表达明显上调(P<0.05)。加入p38抑制剂SB203580处理clone细胞后,通路蛋白及自噬相关蛋白LC3B和beclin1表达下降,表明过表达CLDN6引起的细胞自噬诱导的细胞凋亡可能与p38/CHOP信号通路有关。结论:1.Luminal型、HER2过表达、TNBC-UNS型乳腺癌CLDN6表达水平有差异,绝经后或TNBC型乳腺癌患者CLDN6低表达水平时,预后不良,影响患者生存,CLDN6可作为不同分子亚型乳腺癌患者预后判定非独立性标志物。2.CLDN6信号肽主要定位在内质网膜上,经膜蛋白蛋白途径转至细胞膜,CLDN6的结构和功能与内质网及p38/CHOP通路有关。3.CLDN6经p38/CHOP诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬。