空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种重要的食源性人兽共患病原菌,其感染引起的弯曲菌病可引发多种临床症状,包括腹泻、发烧、呕吐以及血便等。空肠弯曲菌可感染多种动物和人,危害公共安全,现已引起国内外的广泛关注。本研究旨在建立空肠弯曲菌的分子学快速检测方法,分析江苏部分地区肉羊及家禽的感染情况,并对其部分毒力基因进行检测。同时,为建立空肠弯曲菌的免疫学检测方法,利用原核表达系统表达其RacR蛋白并制备多克隆抗体。1.建立空肠弯曲菌的双重PCR检测方法根据空肠弯曲菌的16S rDNA和马尿酸酶基因(hipO)分别设计2对特异性引物,建立了双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增出空肠弯曲菌756 bp大小的16S rDNA基因片段和305 bp大小的hipO片段,而其他8种质控菌株均为扩增阴性。空肠弯曲菌纯培养物的最低检出限为1 pg/μL DNA,污水中空肠弯曲菌的最低检测限为1.5 CFU/mL,羔羊粪便样品中15CFU/g。该方法的建立,为临床上空肠弯曲菌的快速检测提供了技术支持。2.健康肉羊和腹泻畜禽空肠弯曲菌感染情况及耐药性分析2018年3月至2019年9月期间,在江苏主要养殖地区共采集到540份临床健康羔羊肛拭子样品和92份腹泻畜禽肠道样品,并利用所建立的双重PCR方法进行快速检测。结果共检出10份样品(健康肉羊0.74%、腹泻畜禽6.52%)为空肠弯曲菌阳性,其中羊、鸡、鹅的阳性检测率分别为0.71%、10.5%和12.5%。通过细菌分离获得10株空肠弯曲菌,其中羊源4株、鸡源4株、鹅源2株。对10株细菌的特性分析,发现羊源分离株生长活性明显低于鸡源分离株和鹅源分离株,但对小鼠的感染能力高于其他种属分离株。敏感药物试验发现各分离株对磺胺类高度耐药;对头孢菌素类、四环素类、喹诺酮类的耐药性较高。所有分菌株均为多重耐药性菌株,共发现7种耐药谱型,其中以SXT-CRO-TE-CIP型最多。3.分离株的毒力相关基因检测与racR基因保守性分析为了解空肠弯曲菌的毒力基因特性,对其7种主要毒力基因进行PCR检测,发现所检测的菌株均具有温度响应调节基因(racR)(100%),黏附相关基因(peb1A)、趋化调节基因(cheY)、黏附定植基因(cadF)和侵袭蛋白基因(iamA)均为90%,而鞭毛蛋白基因(flaA)仅为50%,未检出质粒基因(virB11)。羊源分离株毒力相关基因检出率高于禽源。所检测的菌株均携带4个以上毒力基因,优势的毒力基因类型为racR-peb1A-che Y-cadF-iamA-flaA和racR-peb1A-cheY-cadF-iamA。通过对 racR的测序,发现该基因在不同菌株之间仅存在个别碱基突变,但未引起氨基酸突变,表明其保守性高,可作为快速检测的备选基因。4.空肠弯曲菌RacR蛋白的表达及多克隆抗体制备通过参考Genbank中基因序列(NC002163.1)设计了 racR编码区的特异性引物。以分离株HC26基因组为模板进行PCR扩增后,将目的片段插入pJET1.2质粒并测序鉴定。用EcoR I和Xho I对重组质粒pJET1.2-racR进行双酶切后,将目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)构建了重组质粒pET28a(+)-racR。含有重组质粒pET28a(+)-racR的大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导后能够可溶性表达融合蛋白His-RacR(29 kD)。以亲和层析柱法与PAGE胶回收试剂盒法纯化获得的His-RacR蛋白免疫接种小鼠后,经间接ELISA方法检测证明了小鼠血清中抗His-RacR抗体效价为1:64000。Western Blot表明该重组蛋白的免疫反应性和抗原性;玻板凝集试验表明该血清能够凝集分离株HC26和标准菌株NCTC11168,可以用于空肠弯曲菌的快速鉴定。