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本研究的目的是掌握HLA-G cDNA的获取以及真核表达载体的构建、鉴定和转染技术,并初步探讨HLA-G基因对NK细胞细胞毒性的抑制作用,为了解其在肿瘤的免疫逃避现象和肿瘤的生物治疗提供实验依据,进而为今后的转基因技术、异种器官移植、组织再生工程奠定基础。实验方法:借助PCR技术扩增HLA-G的cDNA并把其插入真核表达载体pCMV-HA2,成功构建HLA-G的真核表达载体。将HLA-G的真核表达载体利用脂转染法转染至膀胱癌细胞系5637及前列腺癌细胞系PC3,用Western Blot检测其蛋白表达情况,通过与NK细胞共培养,了解HLA-G基因转染肿瘤细胞后,对NK细胞的细胞毒性具有抑制作用。本研究包括三个实验内容。实验一人类HLA-G基因的克隆及真核表达载体的构建和鉴定:从孕妇绒毛组织中提取总RNA,RT-PCR方法获得人绒毛组织的cDNA,以之为模板扩增HLA-G的ORF(含EcoRⅠ和Hind III的酶切位点),PCR产物经EcoRⅠ和Hind III双酶切后,与真核表达载体pCMV-HA2连接,转化至大肠杆菌Topo10’,在LB/Amp平板上筛选阳性克隆菌株,抽提质粒。所获得的重组HLA-G真核表达载体质粒,经进一步PCR、EcoRⅠ和Hind III双酶切及测序鉴定,克隆在pCMV-HA2中的HLA-G基因与Genbank报道的人HLA-G核苷酸序列一致。实验二HLA-G基因的细胞转染及Western Blot鉴定:应用脂质体介导的基因转染技术将真核表达载体pCMV-HLA-G-HA2转入由膀胱癌来源的细胞系5637和前列腺癌来源的细胞系PC3,转染后用Western Blot鉴定表达情况。结果:体外转染24h已有表达,所构建的真核表达载体pCMV-HLA-G-HA2在前列腺癌细胞系PC3及膀胱癌细胞系5637中均可以表达融合蛋白HLA-G-HA2,提示细胞转染成功。