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随着医疗水平的进步,人们已经可以治愈或控制很多种类的疾病,但癌症仍然是导致死亡率最高的疾病之一。临床上对癌症的治疗手段包括传统的手术治疗、化学治疗和放射治疗,但这些药物的毒副作用和高复发率限制了其药效的发挥。近年来,一些优秀的抗肿瘤药物和治疗策略陆续出现,例如靶向治疗药物和免疫治疗等,并取得了良好的疗效,显示出强大的潜力,但高昂的治疗费用也使人们望尘莫及。因此,开发一种高效、低毒、高选择性而不易产生耐药性的抗肿瘤药物迫在眉睫。抗癌肽（ACP）由于其具有广谱的抗癌活性、杀灭癌细胞迅速、不受传统化疗耐药突变的影响、与传统抗肿瘤药物具有良好的协同效应、有一定的选择性以及突出的组织渗透性等特点,使其具备开发成为高活性、低毒性、高组织渗透性的新一代抗肿瘤药物的潜质,然而,如何进一步提高其针对肿瘤的靶向性仍叩待解决。本研究以阳离子膜活性抗癌肽HPRP-A1以及肿瘤凋亡诱导肽kla为研究对象,将肿瘤靶向/穿透肽iRGD和细胞穿透肽TAT通过共给药和共价偶联修饰等方式,对HPRP-A1和kla进行修饰和改造,以提高其抗癌活性、肿瘤穿透性以及靶向性,探索新的抗癌药物研发和治疗策略。1.阳离子抗癌肽HPRP-A1与肿瘤靶向肽iRGD共给药及其机理研究iRGD是广泛应用的肿瘤靶向/穿透肽,由于其内涵的RGD片段可以首先与整合素蛋白超家族αvβ3和αvβ5进行特异性结合,使与其共给药的药物分子具有肿瘤靶向性,通过酶切暴露CRGDK片段后,进一步与细胞膜表面的NRP-1受体特异性结合,使与其共给药的药物分子具有更强的肿瘤渗透性。在本研究中,我们研究了HPRP-A1与iRGD共给药后对A549细胞体内外抗癌活性、对A549细胞3D细胞球的渗透性以及抗癌机理。结果证实,iRGD可以通过共给药的方式显著提高HPRP-A1对非小细胞肺癌A549细胞系的抗癌活性以及特异性,同时通过提高其对膜的通透性而使细胞摄取率提高,更多的多肽进入细胞后通过与线粒体膜作用,诱导caspase依赖性的细胞凋亡。这些研究结果证实将阳离子抗癌肽与肿瘤靶向肽共给药也是一种提高抗癌肽活性和靶向性的有效途径。2.阳离子抗癌肽HPRP-A1的靶向修饰及其机理研究进一步,我们将肿瘤靶向肽iRGD共价偶联修饰到阳离子抗癌肽HPRP-A1的C-末端,设计合成出新的包括抗癌活性域和肿瘤靶向域的杂合肽HPRP-A1-iRGD。以NRP-1高表达的A549细胞、MDA-MB-231细胞以及NRP-1低表达的HUVEC细胞为模型,测试修饰前后多肽体内外膜选择性,同时,评价了多肽对A549 3D细胞球的渗透性以及A549异种移植肿瘤模型裸鼠的肿瘤聚集性。与亲本肽HPRP-A1相比,HPRP-A1-iRGD展示出对NRP-1高表达细胞膜的高选择性、对3D细胞球更深的渗透距离以及对肿瘤模型鼠更强的肿瘤聚集性。为了进一步探索HPRP-A1-iRGD的作用机理,我们利用pull-down实验和生物膜干涉技术（BLI）对HPRP-A1-iRGD与NRP-1靶蛋白之间的亲和力进行了定性和定量检测。结果显示HPRP-A1-CRGDK与NRP-1蛋白之间具有特异性结合能力,并且结合解离常数在纳摩尔级别,其结合能力明显强于单独的HPRP-A1,说明这种高亲和力是通过CRGDK这一iRGD酶切后暴露出的motif实现的。本研究结果提示iRGD共价偶联修饰在HPRP-A1的C-末端也是一种有效的提高阳离子抗癌肽活性、渗透性及其靶向性的策略。3.kla-TAT分别与HPRP-A1和iRGD共给药的作用研究凋亡诱导肽D（KLAKLAK）2,全部用D型氨基酸组成,也称为D（KLA）2,本文中简写为kla。kla是一类诱导细胞凋亡的抗癌肽,但其进入细胞内部的能力偏弱,因此,对其进行化学修饰及改造以提高其癌细胞的摄取率是提高抗癌活性的重要环节。本研究中,我们将经典的肿瘤穿透肽TAT共价偶联于kla的C-末端,形成新的杂合肽kla-TAT。结果证实,与文献报道的TAT共价偶联于kla的N-末端不同,偶联于C-末端后使得两个不具备破膜能力的多肽转化成膜活性肽,赋予了多肽新的属性。kla-TAT可以通过破膜和网格蛋白依赖的胞吞两种途径穿过细胞膜进入细胞内部,同时,kla-TAT的体外抗癌活性较kla提高24倍。TAT与kla共价偶联提高了kla的体外抗癌活性以及肿瘤细胞的摄取效率,是否可以通过降低其用量进一步降低其潜在的毒性?HPRP-A1本身具有良好的抗癌活性以及与其他药物分子良好的协同作用,我们进一步将kla-TAT与HPRP-A1进行共给药研究。结果证实,kla-TAT与HPRP-A1通过互补的作用机理对多种癌细胞具有了更强的协同抗癌活性。对于细胞摄取,一方面,kla-TAT通过TAT诱导的胞吞途径进入细胞内,另一方面HPRP-A1通过改变癌细胞膜的完整性,使更多的kla-TAT进入细胞内部;对于抗癌机理,一方面,kla-TAT通过kla的快速诱导凋亡作用杀灭癌细胞,另一方面,HPRP-A1通过破膜诱导细胞坏死和破坏线粒体膜诱导癌细胞凋亡。无论是单独的kla-TAT还是与HPRP-A1的共给药,都缺少对癌细胞的靶向性。前期的工作已经证明iRGD可以通过共给药的方式提高HPRP-A1的活性以及癌细胞选择性,因此,我们将kla-TAT与iRGD进行共给药,测试了共给药多肽对A549单层细胞以及3D细胞球的渗透性以及对细胞膜的选择性。进一步,通过小动物活体成像技术对共给药多肽在A549异种移植裸鼠模型中在肿瘤部位的富集性进行了验证,实验结果表明kla-TAT可以通过与iRGD共给药的方式提高其肿瘤细胞特异性。综上所述,本论文主要以阳离子抗癌肽HPRP-A1和凋亡诱导肽kla为研究对象,利用肿瘤靶向肽或肿瘤穿透肽进行共价偶联修饰或共给药,都可以很好的提高抗癌肽的体内外活性、靶向性及组织细胞穿透性。这种共价偶联修饰或与iRGD共给药的策略为临床用药提供有价值的理论支持。