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奶牛乳腺纤维化是一种以细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积和肌成纤维细胞过度增殖为特征的疾病。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是导致奶牛慢性乳腺炎的主要病原菌之一,其持续感染引起乳腺结构损伤,进而发展为纤维化,甚至乳腺硬化。本课题组前期的研究均未涉及到调控ECM降解代谢的内容,也未见国内外的相关研究报道。因此,本文通过体内和体外研究S.aureus诱导乳腺纤维化过程中MMPs/TIMPs与uPA系统的表达以及其相关通路,以探讨S.aureus诱导乳腺纤维化的分子机制。本试验采用0、105、106、108 CFU/mL热灭活的S.aureus菌液作用于体外培养的BMFBs和BMECs,于6 h、12 h、24 h、48 h提取细胞的总RNA和总蛋白,通过qPCR、Western blot 方法检测 MMP-1、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPA、uPAR、PAI-1和COL I mRNA和蛋白的表达水平,并通过胶原酶谱试验检测细胞液上清液中MMP-2和-9的活性;筛选106 CFU/mL热灭活的S.aureus作用BMFBs 6 h,进行转录组测序,利用生物信息学分析差异表达基因及信号通路,采用qPCR、Western blot方法检测ERK1/2、P38、JNK及其磷酸化水平的表达,添加MAPKs特异性抑制剂,通过胶原酶谱试验检测细胞液上清液中MMP-2的活性,应用Western blot方法检测MMP-2/TIMP-1、-2及uPA/PAI-1的表达水平;利用S.aureus感染的小鼠乳腺纤维化模型,Masson染色观察各组小鼠在不同感染时期纤维化的情况,采用qPCR从基因水平检测MMP-1、-3、-13、TIMP-1、uPA和PAI-1的表达情况,采用免疫组化法检测MMP-1、-3、-13、TIMP-1、uPA和PAI-1的表达及分布情况。结果显示:(1)不同浓度热灭活的S.aureus1对BMFBs MM-P、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPA、uPAR、PAI-1和COL I mRNA的表达均有不同程度的上升趋势,但在后期升高趋势平缓,蛋白的表达随时间的延长其表达量也呈上升趋势。MMP-2较MMP-9的活性较明显,但其二者活性在24 h和48 h均显著增高。BMECs MMP-1、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPAR和COLI mRNA的表达均有不同程度的上升趋势,但显著变化趋势集中在6h和48h,而uPA、PAI-1 mRNA的表达随作用时间的延长呈现下降趋势,但 MMP-1、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPA、uPAR、PAI-1和COL I蛋白的表达随作用时间的延长呈现上升趋势。MMP-2和MMP-9的活性相当,其二者活性在24 h和48 h均显著增高。BMFBs和BMECs MMP-1、-2、-3、-9、-13、TIMP-1、-2、uPA、uPAR、PAI-1和COL I的表达随时间的变化趋势显示:BMFBs MMP-1、-2、-9、-13和uPA均有一定的下降趋势,且与COL I的表达趋势相反,MMP-3与COLI的表达趋势一致,呈上升趋势,TIMP-1、-2及PAI-1表现出一定上升趋势,表现出抑制作用。BMECs MMP-2、-3、-9、uPA及TIMP-1、-2均与COL I表达趋势一致,且在12 h达到上升峰值,随后逐渐趋缓,MMP-1、-13及PAI-1均与COLI表达趋势相反,出现较明显的下降趋势。(2)转录组学分析表明S.aureus诱导BMFBs MMPs、TIMPs、大量的胶原蛋白和uPA系统的表达,涉及PI3K-Akt、Toll样受体、MAPKs、TNF和IL-17信号通路。(3)热灭活S.aureus促进BMFBs P38、JNK和ERK1/2 mRNA的表达及其磷酸化蛋白的表达,MAPKs(ERK1/2、P38、JNK)特异性抑制剂均能抑制MMP-2的分泌活性,且在24 h抑制效果较为显著。MAPKs特异性抑制剂减弱S.aureus诱导的MMP-2、TIMP-1、-2、uPA和PAI-1的表达,在24 h抑制效果较为显著,且存在抑制剂联合作用的效应。(4)S.aureus诱导小鼠乳腺纤维化,促进乳腺组织中MMP-1、-3、-13、TIMP-1和uPA/PAI-1的表达,且MMP-1、-3、-1 3/TIMP-1和uPA/PAI-1主要在巨噬细胞、乳腺上皮细胞、增生的成纤维细胞中表达。结论:本研究表明不同浓度的热灭活S.aureus诱导BMFBs和BMECs中MMP-1、-2、-3、-9、-13和TIMP-1、-2的表达,并激活uPA系统参与调控MMPs的表达及活性;MAPKs信号通路参与调控几种主要的MMPs/TIMPs及uPA/PAI-1的表达;S.aureus诱导的小鼠乳腺纤维化模型,乳腺组织中MMP-1、-3、-13、TIMP-1和uPA/PAI-1的表达升高,并且其主要在巨噬细胞、乳腺上皮细胞、增生的成纤维细胞中表达。