【摘 要】
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乳酸菌作为青贮添加剂中的重要微生物,其产酸性能直接决定青贮饲料发酵效果的好坏。青贮原料中大量存在的难以降解的木质素也是影响青贮饲料品质的原因之一,漆酶参与木质素降解,可以将其降解为单糖,为青贮发酵拓宽底物。本研究对出发菌株植物乳杆菌RSM1进行常压室温等离子体诱变分别获得产酸快和产酸量高的单一突变株,然后通过基因组重排技术,获得产酸快且产酸量高的融合菌株。通过基因工程手段,在大肠杆菌乳酸菌穿梭载体
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乳酸菌作为青贮添加剂中的重要微生物,其产酸性能直接决定青贮饲料发酵效果的好坏。青贮原料中大量存在的难以降解的木质素也是影响青贮饲料品质的原因之一,漆酶参与木质素降解,可以将其降解为单糖,为青贮发酵拓宽底物。本研究对出发菌株植物乳杆菌RSM1进行常压室温等离子体诱变分别获得产酸快和产酸量高的单一突变株,然后通过基因组重排技术,获得产酸快且产酸量高的融合菌株。通过基因工程手段,在大肠杆菌乳酸菌穿梭载体p MG36e的基础上,分别构建有氧表达的乳酸脱氢酶基因ldh A和能够降解木质素的漆酶基因Cot A表达系统并检测功能菌株的相应性能,进而利用同源重组策略将两个基因先后整合到融合菌株染色体上,采用Cre-loxp系统敲除抗性基因,最后获得产酸品质得到提高的植物乳杆菌工程菌株。主要研究结果如下:1.对前期筛选的植物乳杆菌RSM1进行苜蓿裹包实验,测定发酵与营养各项指标,使用SPSS 20.0软件进行数据分析,参考紫花苜蓿青贮饲料质量分级标准,将添加了植物乳杆菌RSM1的紫花苜蓿青贮饲料质量水平定为二级标准。为获得更好的青贮效果,本研究将从加快乳酸菌定植和提高青贮原料中木质素利用率两方面进一步提高植物乳杆菌RSM1的产酸品质。2.以植物乳杆菌RSM1为出发菌株,ARTP诱变获得了产酸快的突变株RSM-20和产酸量高的突变株RSM-33。将这两株正突变株作为亲本,利用基因组重排技术进行原生质体融合,获得产酸快且产酸量高的融合菌株RSM-F4。经产酸速率测定,融合菌株RSM-F4的产酸时间较原始菌植物乳杆菌RSM1提前了2.0 h,发酵24 h后的最终p H为3.53,比原始菌植物乳杆菌RSM1降低了8.2%。3.根据植物乳杆菌密码子偏好性对来自米根霉的ldh A乳酸脱氢酶基因和来自枯草芽孢杆菌的Cot A漆酶基因进行序列优化,并设计在Cot A基因序列中添加Slp A启动子,合成的序列分别与表达质粒p MG36e连接后电转入融合菌株RSM-F4中。产酸速率测定结果表明:ldh A乳酸脱氢酶基因能够在植物乳杆菌中发挥好氧乳酸发酵作用,在有氧条件下,重组菌株RSM-F4-ldh A比融合菌株RSM-F4产酸能力强。木质素亮蓝功能培养基验证结果表明:Cot A漆酶基因成功表达并分泌到胞外,重组菌株RSM-F4-Cot A相比于融合菌株RSM-F4可以分泌漆酶,降解木质素形成透明圈。4.构建打靶载体p NZ5319-RM-P-ldh A和p NZ5319-LA-S-Cot A,以染色体分散整合方式将ldh A基因和Cot A基因整合到融合菌株RSM-F4染色体不同位点上,使用启动子Slp A启动Cot A表达,启动子ldh L启动ldh A表达,利用Cre-loxp系统删除氯霉素抗性基因,获得整合了两个外源基因的重组植物乳杆菌RSM-F4-P-ldh A-S-Cot A。RT-PCR检验结果显示,重组植物乳杆菌RSM-F4-P-ldh A-S-Cot A中的ldh A乳酸脱氢酶基因和Cot A漆酶基因成功表达。且产酸速率测定和功能培养基验证结果显示,重组植物乳杆菌RSM-F4-P-ldh A-S-Cot A具有相应功能,产酸品质得到提高。综上所述,本研究通过基因组重排技术和基因工程技术获得一株产酸快且产酸量高,能够降解木质素,在有氧时也能发酵产酸的植物乳杆菌工程菌株,是一株具有潜在应用价值的工程乳酸菌。还建立了在植物乳杆菌中以质粒型和整合型两种方式表达外源基因的可行方案,为进一步提高乳酸菌青贮添加剂青贮效果的研究提供了有效手段。
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