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目的c-Maf蛋白在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)中高表达,是MM的主要致病蛋白之一。泛素-蛋白酶体途径是c-Maf蛋白的主要降解通路,寻找与c-Maf相关的特异性泛素化酶及去泛素化酶并阐明其作用机制对于MM的治疗有着重要意义。目前尚不清楚有哪些酶参与了c-Maf的泛素化过程,因此本实验利用亲和纯化耦联质谱法(Affinity purification coupled with tandem mass spectrometry,AP-MS)筛选并鉴定了c-Maf蛋白的去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB)USP5,进一步研究其对c-Maf蛋白泛素化水平和蛋白稳定性的影响,以期为MM的靶向治疗提供一定理论依据。方法1.在HEK293T细胞中转染c-Maf质粒,使c-Maf蛋白过表达,并检测与c-Maf其具有相互作用的蛋白质,与数据库比对分析质谱结果中的泛素化酶及DUBs;2.质谱分析的结果提示去泛素化酶USP5可能和c-Maf结合,因此共转染c-Maf和USP5质粒,用特异性抗体通过免疫沉淀富集c-Maf蛋白,检测USP5与c-Maf是否具有共结合的相互作用;并检测在泛素过表达的情况下,USP5对c-Maf泛素化水平是否具有抑制作用;3.在过表达c-Maf及USP5的情况下,Western blot(WB)检测c-Maf蛋白水平的变化,分析USP5对c-Maf蛋白稳定性影响的量效、时效关系;过表达c-Maf及USP5,36 hr后用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理不同时间,WB检测c-Maf蛋白水平,分析USP5对c-Maf蛋白半衰期的影响;4.c-Maf属于大Maf家族成员之一,而另外两个大Maf家族成员MafA及MafB也都与MM的发生具有一定的关系,为了分析USP5对c-Maf的蛋白稳定作用是否具有一定的特异性,分别利用WB及CHX研究了USP5对MafA、MafB蛋白水平及半衰期的影响;5.细胞周期蛋白d2(cyclind2,ccnd2)是c-maf的下游靶基因之一,为了研究usp5的去泛素化作用对c-maf蛋白功能的影响,本实验构建了荧光素酶-ccnd2启动子质粒(pgl4-ccnd2-luci),与usp5、c-maf质粒共转染48hr,分析荧光素酶活性的变化,同时wb检测c-maf的蛋白水平,以分析usp5对c-maf转录活性的影响;6.c-maf蛋白共有14个有可能发生泛素化的赖氨酸残基,为了明确usp5的具体作用位点,本实验构建了12个c-maf单赖氨酸位点突变体,以及1个33/34位点的双位点突变体,将各突变体分别与usp5质粒共转染,wb检测usp5对各c-maf突变体蛋白水平的影响,分析usp5使c-maf发生去泛素化的可能位点;7.usp5共有5个功能结构域,本研究分别构建了usp5不同结构域的5种截断体,并分别与c-maf质粒共转染,wb检测不同截断体对c-maf蛋白水平的影响,分析usp5的哪些结构域可以增强c-maf蛋白的稳定性;8.临床上c-maf主要在mm患者中高表达,并与mm的发生及预后密切相关。我们前期的研究发现大部分mm细胞株都存在c-maf的高表达情况,usp5作为c-maf的候选dub,是否也存在不同种类细胞株的差异性表达情况?本研究分别收集了mm细胞株、白血病细胞株以及其他多种实体瘤细胞株,wb检测usp5在不同肿瘤细胞中的蛋白表达水平。结果1.在hek293t细胞株中过表达c-maf后,ap-ms发现共有104个蛋白质出现了特异性表达,提示这些蛋白可能存在与c-maf的相互作用关系。经过比对数据库的检索及功能分析,发现去泛素化酶usp5的表达与c-maf显著相关,可能是c-maf的特异性dub;2.共转染usp5及c-maf的情况下,usp5与c-maf蛋白发生了明确的共沉淀作用,usp5也显著降低了c-maf蛋白的泛素化水平;3.随着usp5质粒转染量的提高以及转染时间的延长,c-maf蛋白水平逐渐提高,提示usp5对c-maf的降解具有抑制作用,并使c-maf蛋白的半衰期延长;4.usp5也可使mafb的蛋白水平提高,半衰期延长;但是其对mafa的蛋白水平和半衰期没有明显变化,提示usp5对c-maf的作用具有一定程度的选择性和特异性;5.USP5使c-Maf下游靶基因CCND2的荧光素酶活性增强,提示其对c-Maf蛋白的稳定作用使c-Maf的转录活性得到提高;6.USP5可使c-Maf的K347位点突变体、K308位点突变体的蛋白水平提高,提示USP5使c-Maf发生去泛素化的作用位点可能是K347和/或K308赖氨酸残基;7.USP5的5种截断体中,UBA1-UBA2结构域使c-Maf的蛋白水平提高;8.USP5在MM细胞株中的蛋白表达水平比其他细胞系高。结论本实验利用AP-MS筛选并发现了与c-Maf相关的去泛素化酶USP5,进一步的分子生物学实验发现USP5与c-Maf存在蛋白间的相互结合,过表达USP5可以降低c-Maf的泛素化水平,使c-Maf的蛋白水平增高、半衰期延长、转录活性提高,提示USP5可能是c-Maf的DUB。进一步的研究发现USP5主要作用于c-Maf的K347和/或K308位点,主要通过其UBA1-UBA2结构域发挥稳定c-Maf的作用。另外,相比于白血病细胞株以及乳腺癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌等实体瘤细胞株,USP5在MM中呈现出高表达,与c-Maf的表达谱类似。