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研究背景肺癌是全球癌症患者死亡的主要原因,中晚期非小细胞肺癌（Non-smallcell lung cancer,NSCLC）患者的五年生存率仅为10%-20%。随着肿瘤免疫治疗的兴起,这一高效低毒的治疗方式为NSCLC患者带来新的希望。免疫治疗通过激活人体免疫系统,依靠自身免疫机能杀灭癌细胞。虽然免疫疗法的成功令人振奋,但程序性死亡蛋白-1（Programed cell death protein-1,PD-1）单抗在 NSCLC 患者中单药治疗有效率仅约20%。根据我们前期数据统计,对长期低淋巴细胞血症的患者,免疫治疗相较于标准疗法,并未显著改善患者预后。因此,我们定义本部分人群为“弱淋巴细胞恢复力”患者:其在接受免疫治疗前,外周血淋巴细胞绝对值（Absolute lymphocyte count,ALC）曾持续低于正常水平超过3周,至接受免疫治疗时仍未恢复正常。目前,如何提高PD-1抑制剂疗效、特别是在弱淋巴细胞恢复力患者中提高疗效,仍有待进一步研究。为提高反应率,许多研究评估了抗PD-（L）1药物联合其他免疫制剂的疗效,发现这些组合具有一定局限性,如叠加毒副反应、给药便利性下降。双特异性抗体（以下简称:双抗）是新型第二代免疫治疗抗体,代表药物包括M7824、SHR-1701等。其中,SHR-1701作为新型双功能融合蛋白,由抗程序性死亡配体-1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）单抗及转化生长因子-β Ⅱ型受体（Transforming growth factor beta receptor Ⅱ,TGF-βRⅡ）融合而成。与免疫单抗相比,双抗药物在弱淋巴细胞恢复力患者中疗效如何尚无报道,具体机制也有待阐明。本研究利用多种技术手段,分两部分深入研究弱淋巴细胞恢复力造成肺癌免疫治疗耐药的机制及免疫双抗药物在小鼠肺癌模型中的应用机制,为肺癌免疫双抗药物的适用人群选择以及未来药物研发提供新思路。第一部分:弱淋巴细胞恢复力导致肺癌免疫治疗耐药的机制研究目的:（1）探究患者外周血淋巴细胞数目对免疫治疗疗效与患者预后的意义;（2）建立肺癌原位小鼠模型,探究弱淋巴细胞恢复力状态下,外周血及外周淋巴器官中CD8+T/调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）的分布及功能变化;（3）明确PD-1抑制剂单药用于弱淋巴细胞恢复力小鼠的疗效及耐药机制。材料与方法:（1）回顾性搜集205例应用抗PD-1/PD-L1抗体肺癌患者的临床资料,并进行随访。将TNM分期、淋巴细胞恢复力等纳入多因素Cox回归分析,绘制Kaplan-Meier（K-M）生存曲线;（2）收集正常及弱淋巴细胞恢复力肺癌患者的外周血,利用流式细胞术分析CD8+T及Treg细胞的含量差异;（3）构建萤火虫荧光素酶（Firefly-luciferase）慢病毒,感染小鼠肺癌CMT167细胞系,经嘌呤霉素筛选后得到表达luciferase基因的稳转细胞系（CMT167-luc）;（4）应用CMT167-luc细胞系构建小鼠肺原位成瘤模型,后连续4天给予化疗药物顺铂（Cisplatin,DDP）,4 mg/kg,构建弱淋巴细胞恢复力肺癌小鼠模型。应用流式细胞术及免疫组化染色（Immunohistochemistry,IHC）检测外周血/肿瘤微环境中CD8+T及Treg细胞含量,转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）分析CD4+/CD8+T细胞下游信号通路变化,苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察胸腺及脾脏结构形态变化;（5）根据5种临床常见肺癌治疗模式将原位肺癌小鼠分5组给予治疗,利用小动物活体成像技术观察不同治疗模式下的肿瘤生长速度,记录小鼠生存期;（6）利用流式细胞术及IHC染色技术,明确淋巴细胞恢复力调控免疫治疗疗效的潜在机制;（7）利用IHC染色及酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）筛选潜在干预靶点Interleukin-2（IL-2）及 TGF-β。结果:（1）患者淋巴细胞恢复力与免疫治疗PFS显著相关。低淋巴细胞数目导致中性粒细胞/淋巴细胞比值（Neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）及血小板/淋巴细胞比值（Platelets-to-lymphocytes ratio,PLR）上调,提示不良预后。进一步亚组分析显示,淋巴细胞恢复力与PFS呈正相关;（2）顺铂对淋巴细胞恢复力的影响以及对免疫微环境的调控。顺铂诱导弱淋巴细胞恢复力,下调小鼠外周血/胸腺/脾脏中CD8+T/Treg 比值。CD3/CD28共刺激实验证实CD8+T细胞的增殖及活化潜能受抑制。RNA-seq结果显示,CD4+T细胞亚群富集Treg分化的相关基因,同时CD8+T细胞功能相关基因表达下调,提示肿瘤微环境处于免疫抑制状态;（3）一代PD-1抑制剂用于弱淋巴细胞恢复力小鼠疗效不佳,TGF-β或可作为潜在干预靶点。原位肺癌小鼠体内实验证明,无论同步或序贯模式,一代PD-1抑制剂用于弱淋巴细胞恢复力小鼠疗效不佳。通过IHC染色进一步筛选出IL-2及TGF-β两个重要靶点,最终通过ELISA检测确定TGF-β为下一步研究的干预靶点。结论:临床数据及动物模型表明,既往化疗可破坏部分患者CD8+T与Treg细胞平衡,抑制淋巴细胞稳态恢复,导致PD-1单药治疗反应欠佳。TGF-β可作为克服免疫耐药的潜在干预靶点。第二部分:免疫双抗药物增加弱淋巴细胞恢复力肺癌免疫治疗敏感性的机制探索目的:（1）验证免疫双抗药物SHR-1701（PD-L1/TGF-βRⅡ融合蛋白）在小鼠模型中的疗效,探索其逆转免疫抑制微环境的作用机制;（2）验证不同淋巴细胞恢复力状态下,一代免疫单抗药物与二代双抗药物在肺癌患者外周血中的疗效对比;（3）探索双抗药物对Treg和CD8+T细胞内PI3K/Akt以及TGF-β信号通路的调控。材料与方法:（1）在本研究第一部分基础上,增加第6组治疗模式:顺铂化疗后给予免疫双抗药物SHR-1701,并利用小动物活体成像及K-M生存曲线分析荷瘤小鼠肿瘤及生存期变化;（2）利用流式细胞术及IHC染色,探索SHR-1701 对低淋巴细胞恢复力小 鼠肿瘤/胸腺/脾脏中 CD8+T 和 Treg 增殖活性的影响;（3）应用SHR-1701处理低淋巴细胞血症肺癌患者的外周血单个核细胞,流式细胞术检测CD8+T细胞活化相关蛋白表达;（4）分选患者外周CD4+T及CD8+T 细胞,利用 Western Blot 检测 SHR-1701 对 TGF-β 以及 PI3K/Akt 信号通路的调控。结果:（1）SHR-1701可以克服对PD-1单抗的获得性耐药:小鼠体内实验证实,相比于PD-1单抗,SHR-1701应用于顺铂诱导的弱淋巴细胞恢复力小鼠,可促进更显著的肿瘤消退及延长小鼠生存时间;（2）SHR-1701对小鼠肺原位瘤/脾脏免疫微环境的调控:IHC染色提示,应用SHR-1701后,弱淋巴细胞恢复力小鼠肿瘤微环境中CD8+T细胞数目增加,Treg减少。提取肿瘤及脾脏中的CD8+T细胞,给予CD3/CD28共刺激,发现接受SHR-1701治疗的小鼠,其GITR+/IFN-γ+/CD69+CD8+T细胞数目显著增加,提示CD8+T细胞进入增殖、分化活跃期;（3）SHR-1701促进弱淋巴细胞恢复力肺癌患者外周CD8+T细胞的增殖分化:使用SHR-1701处理弱淋巴细胞恢复力肺癌患者的外周血单个核细胞,发现SHR-1701能够有效促进其外周CD8+T细胞内IFN-γ产生和Ki-67表达;（4）SHR-1701对患者外周淋巴细胞信号通路的调控:SHR-1701可抑制TGF-β信号通路,激活PI3K/Akt信号通路,挽救弱淋巴细胞恢复力的肺癌患者外周血中CD8+T细胞的抗肿瘤功能。结论:TGF-βR抑制剂可逆转顺铂诱导的CD8+T和Treg失衡。使用SHR-1701同步阻断TGF-βR与PD-L1在伴有顺铂诱导的弱淋巴细胞恢复力模型中可更好的抑制肿瘤。