论文部分内容阅读
芳香族化合物广泛分布在自然环境中，因其具有可远距离迁移、难自然降解和易被生物积累等特性可在地球生态系统中持久存在。大气、土壤及水体中的芳香族污染物对人类健康造成潜在的危害，在某些特定条件下具有强致癌、致畸和致突变性。目前对于芳香族污染物的处理方法主要有物理方法、化学方法和生物方法等，其中生物方法由于其无二次污染、环境友好等优点，被广泛用来处理芳香族污染物。微生物燃料电池（microbiol fuel cell，MFC）是一种将生物降解与电化学技术相结合，利用阳极微生物将污染物中的化学能直接转化成电能的技术。微生物的胞外电子传递是MFC运行和应用的基础。已有报道的胞外电子传递主要有直接接触、中介体介导及纳米线三种方式，但胞外电子传递的机制目前研究还不够深入透彻。
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）可以高效代谢多种芳香化合物，是清除环境中芳香类污染物的最佳选择之一。本论文所用的实验菌株P.putida B6-2是许平教授课题组前期从石油污染土壤中筛选获得。该菌株具有高效降解多种芳香族化合物的能力，对复合污染环境生物修复具有极大潜力。本研究首先以P.putida B6-2为阳极微生物构建MFC，研究其对多种芳香族模式污染物的降解与同步产电。并通过电化学、扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）和原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)初步分析了P.putida B6-2的胞外电子传递途径。在此基础上，通过转录组学数据分析结合分子生物学方法寻找胞外电子传递相关的关键基因并进行功能探究。本论文的主要研究内容和结果如下:1)MFC中P.putida B6-2对不同芳香族污染物的降解与同步产电。以P.putida B6-2为阳极微生物构建MFC，考察了MFC中P.putida B6-2对多种芳香族模式污染物的降解与同步产电，如联苯(biphenyl，BP)、二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)和咔唑(carbazole，CA)。实验结果表明，在MFC中P.putida B6-2对BP、DBT和CA都有较强降解能力。以BP为唯一底物时，P.putida B6-2可在200h内将462mg L-1BP完全降解;以BP（462mg L-1）、DBT(55mg L-1)和CA(50mg L-1)三种混合物为底物时，P.putida B6-2仍可在200h内将三种物质基本降解完全。此外，以P.putida B6-2为阳极微生物构建的MFC均表现出良好的产电性能。单底物和混合底物构建的MFCs的产电趋势相似，产电周期约为1000h，在起始阶段，以BP为底物时构建的MFC相较其他三个MFC启动期更短(50h)。在产电稳定期，以BP、DBT和CA为共底物时构建的MFC产电峰值达到了473mV，以BP为底物时的MFC次之(446mV)，而以BP和CA为共底物时产电峰值只有334mV。与产电周期相似，MFC的最大功率密度排序如下:以BP、DBT和CA为共底物的MFC(642mW m-2)＞以BP为底物的MFC(550mW m-2)＞以BP和DBT为共底物的MFC(484mWm-2)＞以BP和CA为共底物的MFC(427mW m-2)。综上所述，以P.putida B6-2为阳极微生物构建的MFC，不仅可以高效降解多种芳香族化合物，还可以实现能源的回收利用。
2)P.putida B6-2的胞外电子传递途径初步探究。首先通过电化学的循环伏安方法(cyclic voltammetry，CV)分别考察了阳极生物膜和阳极液的电化学活性。在产电结束期，阳极生物膜的响应电流没有出现明显的氧化还原峰，这表明在MFC中P.putida B6-2可能不利用氧化还原蛋白进行直接的胞外电子传递，而阳极液的CV曲线中出现一对明显的氧化还原峰（-0.1V和0.2V），这表明阳极液中有氧化还原物质，进而推测在MFC中P.putida B6-2可能利用电子中介体进行间接的胞外电子传递。但这对氧化还原峰是在产电结束期才能被观察到。另外，使用SEM研究了稳定期的阳极生物膜。SEM形貌表征结果显示在产电稳定期，阳极生物膜中的P.putida B6-2细胞表面形成致密的纳米线状胞外附属物。之后，利用SEM对产电过程中阳极生物膜的形成过程进行了系统地表征，发现P.putidaB6-2细胞表面纳米线伴随着产电过程而形成。结合电化学分析结果和整个产电过程分析推测P.putida B6-2生成的纳米线可能与产电相关。基于以上推测，采用AFM对P.putida B6-2生成的纳米线进行导电性表征，但由于样品处理过程中，纳米线被破坏，未能在AFM下观察到P.putida B6-2生成的纳米线，因此无法直接测定其导电能力。
3)P.putida B6-2的转录组测序和差异基因敲除。以P.putida B6-2为实验菌株，BP为底物，分别在摇瓶和MFC条件下进行培养，当MFC处于稳定放电且生物膜生长良好的时期时和摇瓶培养处于对数生长期时分别收集阳极生物膜和摇瓶培养液中P.putida B6-2菌体，提取两种不同条件下的细菌总RNA，进行原核转录组测序。对获得的结果进行分析，推测P.putida B6-2的纳米线状胞外附属物与鞭毛基因fliC相关。之后，利用同源重组技术对fliC进行敲除，将获得的敲除菌株与野生型菌株在MFC条件下进行培养，对两者降解BP情况、产电能力和纳米线生长等指标进行比较，判断鞭毛基因fliC的功能。最后，根据fliC基因构建回补质粒，将回补质粒转化进入敲除菌株获得回补菌株，筛选、验证，并观察回补菌株的产电性能等参数变化，与敲除菌株和野生型菌株比较，从而进一步确定鞭毛基因fliC与MFC中P.putida B6-2产生的纳米线状胞外附属物相关。
综上所述，P.putida B6-2在MFC中不仅可以实现多种芳香族污染物的降解，还可以实现同步产电。此外，通过电化学分析及电镜微观表征等手段，首次发现P.putida B6-2可能通过纳米线实现胞外电子传递过程。经转录组分析、基因敲除等方法，初步确定鞭毛基因fliC可能与P.putida B6-2的纳米线状胞外附属物相关。
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）可以高效代谢多种芳香化合物，是清除环境中芳香类污染物的最佳选择之一。本论文所用的实验菌株P.putida B6-2是许平教授课题组前期从石油污染土壤中筛选获得。该菌株具有高效降解多种芳香族化合物的能力，对复合污染环境生物修复具有极大潜力。本研究首先以P.putida B6-2为阳极微生物构建MFC，研究其对多种芳香族模式污染物的降解与同步产电。并通过电化学、扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）和原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)初步分析了P.putida B6-2的胞外电子传递途径。在此基础上，通过转录组学数据分析结合分子生物学方法寻找胞外电子传递相关的关键基因并进行功能探究。本论文的主要研究内容和结果如下:1)MFC中P.putida B6-2对不同芳香族污染物的降解与同步产电。以P.putida B6-2为阳极微生物构建MFC，考察了MFC中P.putida B6-2对多种芳香族模式污染物的降解与同步产电，如联苯(biphenyl，BP)、二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)和咔唑(carbazole，CA)。实验结果表明，在MFC中P.putida B6-2对BP、DBT和CA都有较强降解能力。以BP为唯一底物时，P.putida B6-2可在200h内将462mg L-1BP完全降解;以BP（462mg L-1）、DBT(55mg L-1)和CA(50mg L-1)三种混合物为底物时，P.putida B6-2仍可在200h内将三种物质基本降解完全。此外，以P.putida B6-2为阳极微生物构建的MFC均表现出良好的产电性能。单底物和混合底物构建的MFCs的产电趋势相似，产电周期约为1000h，在起始阶段，以BP为底物时构建的MFC相较其他三个MFC启动期更短(50h)。在产电稳定期，以BP、DBT和CA为共底物时构建的MFC产电峰值达到了473mV，以BP为底物时的MFC次之(446mV)，而以BP和CA为共底物时产电峰值只有334mV。与产电周期相似，MFC的最大功率密度排序如下:以BP、DBT和CA为共底物的MFC(642mW m-2)＞以BP为底物的MFC(550mW m-2)＞以BP和DBT为共底物的MFC(484mWm-2)＞以BP和CA为共底物的MFC(427mW m-2)。综上所述，以P.putida B6-2为阳极微生物构建的MFC，不仅可以高效降解多种芳香族化合物，还可以实现能源的回收利用。
2)P.putida B6-2的胞外电子传递途径初步探究。首先通过电化学的循环伏安方法(cyclic voltammetry，CV)分别考察了阳极生物膜和阳极液的电化学活性。在产电结束期，阳极生物膜的响应电流没有出现明显的氧化还原峰，这表明在MFC中P.putida B6-2可能不利用氧化还原蛋白进行直接的胞外电子传递，而阳极液的CV曲线中出现一对明显的氧化还原峰（-0.1V和0.2V），这表明阳极液中有氧化还原物质，进而推测在MFC中P.putida B6-2可能利用电子中介体进行间接的胞外电子传递。但这对氧化还原峰是在产电结束期才能被观察到。另外，使用SEM研究了稳定期的阳极生物膜。SEM形貌表征结果显示在产电稳定期，阳极生物膜中的P.putida B6-2细胞表面形成致密的纳米线状胞外附属物。之后，利用SEM对产电过程中阳极生物膜的形成过程进行了系统地表征，发现P.putidaB6-2细胞表面纳米线伴随着产电过程而形成。结合电化学分析结果和整个产电过程分析推测P.putida B6-2生成的纳米线可能与产电相关。基于以上推测，采用AFM对P.putida B6-2生成的纳米线进行导电性表征，但由于样品处理过程中，纳米线被破坏，未能在AFM下观察到P.putida B6-2生成的纳米线，因此无法直接测定其导电能力。
3)P.putida B6-2的转录组测序和差异基因敲除。以P.putida B6-2为实验菌株，BP为底物，分别在摇瓶和MFC条件下进行培养，当MFC处于稳定放电且生物膜生长良好的时期时和摇瓶培养处于对数生长期时分别收集阳极生物膜和摇瓶培养液中P.putida B6-2菌体，提取两种不同条件下的细菌总RNA，进行原核转录组测序。对获得的结果进行分析，推测P.putida B6-2的纳米线状胞外附属物与鞭毛基因fliC相关。之后，利用同源重组技术对fliC进行敲除，将获得的敲除菌株与野生型菌株在MFC条件下进行培养，对两者降解BP情况、产电能力和纳米线生长等指标进行比较，判断鞭毛基因fliC的功能。最后，根据fliC基因构建回补质粒，将回补质粒转化进入敲除菌株获得回补菌株，筛选、验证，并观察回补菌株的产电性能等参数变化，与敲除菌株和野生型菌株比较，从而进一步确定鞭毛基因fliC与MFC中P.putida B6-2产生的纳米线状胞外附属物相关。
综上所述，P.putida B6-2在MFC中不仅可以实现多种芳香族污染物的降解，还可以实现同步产电。此外，通过电化学分析及电镜微观表征等手段，首次发现P.putida B6-2可能通过纳米线实现胞外电子传递过程。经转录组分析、基因敲除等方法，初步确定鞭毛基因fliC可能与P.putida B6-2的纳米线状胞外附属物相关。