研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在恶性肿瘤中最常见且死亡率很高,全球恶性肿瘤死亡率位列第3,严重威胁人们的健康和生命。我国是HCC高发区,流行病学资料显示其高居我国恶性肿瘤死亡率的第2位。目前肝切除和射频消融是肝癌早期的常用治疗手段,中晚期患者可采用肝动脉化疗栓塞、放化疗等手段,但是术后患者极易复发,放疗、化疗等也易使人产生耐药性,预后较差。分子靶向抗肿瘤药物在减少传统化疗药物的全身性毒副作用和提高疗效方面具有一定的优越性,因此,HCC分子靶向药物的开发在控制HCC的肿瘤增殖、延缓肿瘤的复发、转移以及提高患者生活质量等方面均具有重要意义。沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)与酵母SIR2同源,是一类依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。SIRT1定位于细胞核,胚胎早期含量丰富,并在成熟组织中表达广泛,通过去乙酰化修饰组蛋白及多种非组蛋白来调节基因表达,参与细胞凋亡、分化、衰老、应激耐受及能量代谢等多种重要的生理活动。近年来,许多研究表明SIRT1与多种肿瘤的发生发展密切相关,尤其是SIRT1与HCC的关系引起了研究人员的广泛关注。临床研究发现,SIRT1在HCC患者中异常高表达,并可预测其不良预后。进一步的研究表明,SIRT1在HCC细胞的增殖与肿瘤生长中发挥了关键的作用,且作用范围广泛,分子机制复杂。目前,以SIRT1这一新靶点抗肝细胞癌的治疗药物还未见有相关报道。因此,以STRTl为靶点的小分子抑制剂是创新抗肝细胞癌药物开发的方向之一。研究目的本项目基于SIRT1受体,选取EX527、尼克酰胺与SIRT1蛋白的结合位点,通过高通量虚拟筛选和分子模拟等方法,筛选出对接打分较高的小分子抑制剂,在此基础上,再进一步的筛选优化、设计、合成,通过抑制肝癌细胞中SIRT1的高表达,影响肝癌细胞的增殖,对其抗肝癌的活性进行体内外效应实验,为筛选及改造新型的以SIRT1为靶标的抗肝癌活性抑制剂奠定良好的理论基础。研究内容1.基于SIRT1受体的虚拟筛选(1)小分子数据库Drug Bank和Chem下载小分子化合物库,蛋白质数据库PDB下载SIRT1与配体复合物晶体结构(PDB:4I5I);(2)运用分子对接等计算机虚拟筛选的方法,利用分子对接软件Discovery Studio3.0、SYBYL2.0,进行分子对接打分,选出其中与SIRT1活性口袋匹配度最高的小分子抑制剂;(3)分子动力学模拟测定小分子抑制剂与SIRT1受体的结合亲和力,确定潜在活性小分子抑制剂。2.体外抗肝癌活性研究(1)CCK-8法检测HepG2、MDA-231、KM3、K562、Caski、A549、Hela、Jurkat细胞经小分子抑制剂处理48h后的增殖抑制率,初步验证小分子抑制剂是否能够抑制肿瘤细胞生长,并筛选出其对何种肿瘤细胞的增殖抑制最为明显;(2)以肝癌细胞HepG2为靶细胞,CCK-8法比较小分子抑制剂与EX527、尼克酰胺、Sirtinol等SIRT1抑制剂对HepG2细胞的增殖抑制率;(3)CCK-8法检测SIRT1高表达的HepG2细胞、SIRT1低表达的Huh-7细胞及人肝细胞L02经小分子抑制剂、阳性对照药物EX527处理48h后的增殖抑制率,初步验证虚拟筛选获得的小分子抑制剂是否具有SIRT1特异性;(4)对经过阳性对照药物EX527及小分子抑制剂处理48h后的HepG2细胞进行Annexin V-FITC/PI双染,检测对HepG2细胞的诱导凋亡作用。(5)Western blot法检测经不同浓度小分子抑制剂处理48h对HepG2细胞中SIRT1以及相关蛋白的表达情况的影响。3.体内抗肝癌活性研究(1)选取5-7w龄的裸鼠40只,腋下接种成瘤,建立人肝癌HepG2及Huh-7裸鼠模型各20只,随机分为对照组和给药组,腹腔注射小分子抑制剂,每日观察肿瘤的生长情况;(2)处死裸小鼠,摘取瘤体,计算抑瘤率,对瘤体石蜡切片,免疫组化法检测SIRT1、P450蛋白表达情况。研究成果1.以SIRT1(PDB ID:4I5I)为靶标,基于ADME/T性质从Drug Bank和Chem数据库筛选出83745个化合物,然后使用surflex Dock筛选和分子模拟验证获得SIRT1抑制剂小分子抑制剂T;分子动力学模拟计算小分子抑制剂T与SIRT1活性位点结合后的结合自由能,证明小分子化合物T与SIRT1结合较为稳定。2.通过CCK-8增殖抑制试验,结果表明:小分子抑制剂T能够抑制肿瘤细胞生长,尤其对SIRT1高表达的HepG2细胞增殖抑制最为明显,并且与其余三种SIRT1抑制剂相对照,小分子抑制剂T对HepG2的抑制作用呈明显的浓度与时间依赖关系。3.运用Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测结果表明:不同浓度的小分子抑制剂T及阳性对照药物EX527对HepG2细胞均具有诱导凋亡的作用,但小分子抑制剂T处理后的细胞凋亡率远高于阳性对照物EX527。4.Western blot法证实:HepG2细胞中SIRT1蛋白表达随小分子抑制剂T的浓度变化而变化,并且小分子抑制剂T对相关蛋白的表达也有一定影响。5.以高表达SIRT1的HepG2和低表达SIRT1的Huh-7肝癌细胞做为靶细胞,分别接种到裸鼠皮下,建立在体肿瘤模型,每日观察肿瘤的生长情况,结果表明:小分子抑制剂T对HepG2裸鼠模型的肿瘤具有更显著的抑制活性,而对Huh-7裸鼠模型的肿瘤没有抑制活性。6.处死裸小鼠,摘取瘤体,计算抑瘤率,结果表明小分子抑制剂T对HepG2裸鼠模型的抑瘤率明显高于Huh-7裸鼠模型。7.选取瘤体做石蜡切片,免疫组化法检测SIRT1、P450蛋白表达情况,结果表明:HepG2裸鼠模型给药组的SIRT1蛋白表达较对照组低,而P450蛋白表达无明显差异,Huh-7裸鼠模型给药组与对照组SIRT1、P450蛋白表达均无明显差异。研究结果表明本课题基于SIRT1受体,选取EX527、尼克酰胺与SIRT1蛋白的结合位点,通过高通量虚拟筛选和分子模拟等方法,筛选出的小分子抑制剂T不仅在体外试验中能有效地抑制肝癌细胞HepG2增殖并诱导其发生凋亡,在体内试验中对HepG2裸鼠模型的肿瘤生长也具有显著的抑制活性,Western blot试验证实小分子抑制剂T可以特异性的抑制肝癌细胞HepG2中SIRT1的表达,故小分子化合物T有望作为抗肿瘤药物,特别是抗HCC分子靶向药物进行研究。