【摘 要】
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受体细胞中外源基因的表达是植物基因工程中的关键问题,启动子是基因表达的重要调控序列之一,是基因表达调控的关键点。本研究中,通过生物信息学分析得到了一个来自橡胶树白
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受体细胞中外源基因的表达是植物基因工程中的关键问题,启动子是基因表达的重要调控序列之一,是基因表达调控的关键点。本研究中,通过生物信息学分析得到了一个来自橡胶树白粉菌(Oidium heveae B.A.Steinm.)的疑似内源启动子,命名为WY172。通过瞬时表达、GUS染色实验、GUS活性分析等对该启动子功能进行验证,引入外源功能基因HpaXm,通过稳定表达、微过敏、烟草花叶病毒(TMV)接种、实时荧光定量PCR、GUS活性检测等实验对WY172驱动HpaXm基因的表达效果进行探究,并通过诱导元件分析、诱导实验和GUS染色等对WY172的启动子类型进行了分析;采取对WY172启动子上游2K序列进行渐变缺失突变、诱导元件分析和启动子活性分析等方法进行分析,探究WY172是否具有多元化诱导的可能性。主要结果如下:1.获得了重组表达载体pBI121-GFP(转空载体)、pBI121-ACT1(阳性对照)、pBI121-WY172,证明WY172具有启动子功能,可以驱动报告基因GUS的表达,并且在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能发挥启动子作用。2.构建了pBI121-WY172-HpaXm及带有35S的pBI121-HpaXm(阳性对照)植物表达载体,转化获得相应的转基因烟草。微过敏和TMV接种实验证明WY172能够有效地驱动外源功能基因HpaXm的表达,其转基因植物的过敏性反应和抗病性强于阳性对照。同时,这个结果也预示TMV可能诱导WY172的表达,WY172可能是诱导性启动子。3.生物信息学分析,WY172具有生长素响应元件,同时具有光响应元件和两个未知功能的顺式作用元件。诱导实验及qRT-PCR等证明,生长素能够很好诱导WY172的表达,说明WY172可能是一种IAA诱导型启动子。4.克隆了橡胶树白粉菌启动子WY172上游2K序列上4个不同长度缺失片段,GUS染色及酶活性测定结果均显示所有缺失突变片段都具有调控基因表达的启动子活性,且启动活性均强于35S启动子,其中WY172Q3调控GUS基因表达的活性最高。同时发现,WY172启动子上游2K序列具有茉莉酸甲酯响应、赤霉素响应、低温响应等丰富的顺式作用元件。综上所述,本研究得到了橡胶树白粉菌内源启动子WY172,它在单子叶植物水稻和双子叶植物烟草中均能高效表达,并且可能受IAA和TMV的双重诱导,可能具有广泛宿主范围和很高应用潜力。
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