研究背景:肺癌是一种肺部组织内细胞生长失控的疾病,其发病率和死亡率增长很快。根据美国的最新统计数据,肺癌目前是全球癌症死因的第一名,约占全部恶性肿瘤的26%,对人群健康和生命威胁很大,尤其是肺腺癌初诊时大多已是晚期,血行转移较早,多伴血栓形成。肺癌的病因至今尚不完全明确。蛋白质Z(Protein Z,PZ)作为蛋白质Z依赖的蛋白酶抑制剂(Protein Z dependent protease inhibitor,ZPI)的辅因子,主要在ZPI抑制FⅩa的过程中发挥间接抗凝作用,可以使ZPI对FⅩa的抑制作用增强1000倍以上。PZ缺乏时,抑制FXa作用下调,使凝血活性增强,从而可增加血栓形成的危险性。我们前期的临床研究发现随着恶性肿瘤病程进展,PZ血浆水平明显下降,这可能是恶性肿瘤高凝状态形成的一个新的机制。最新的研究发现PZ可以在乳腺癌组织、肺癌组织、结肠癌组织和胃癌组织中过表达或合成,认为PZ可能在肿瘤组织内发挥抗凝血作用,从而可能影响到肿瘤的血管新生、侵袭和转移。为了探索PZ在恶性肿瘤细胞的过表达除了可能与恶性肿瘤血栓形成有关外,是否也和肿瘤的发生、发展及转移相关,我们选取了肺癌类型中最易早期转移及血栓形成的肺腺癌作为研究对象来研究这一问题。目的:1.了解PZ蛋白及m RNA在肺腺癌的表达。2.获得PZ蛋白在肺腺癌生长和转移中发挥重要作用的实验证据。3.探讨PZ在肺腺癌发病、进展、预后中的意义。方法:第一部分免疫组化方法检测正常肺组织、肺腺癌组织PZ的表达收集正常肺组织、肺腺癌组织、癌旁组织标本后,免疫组织化学方法分别检测45例正常肺组织、45例肺腺癌组织及45例癌旁组织PZ的表达。完成统计分析,了解PZ蛋白在肺腺癌中的表达情况及其与性别、分化及分期的关系。第二部分Western blot方法检测肺腺癌组织、肺腺癌旁组织PZ蛋白的表达实验分2组,共45例癌旁组织和45例肺腺癌组织。每个样品收集完成后,液氮中浸置30分钟,转至-70℃冰箱保存。待全部样品收集完成后,对组织标本进行裂解并用玻璃匀浆器匀浆,低温超速离心提取组织蛋白,BCA法测定蛋白浓度。最后进行数据统计分析,进一步证实PZ蛋白在肺腺癌中的表达情况及其与性别、分化及分期的关系。第三部分Western blot方法检测正常支气管细胞及肺腺癌细胞PZ蛋白的表达培养人正常支气管上皮细胞及肺腺癌细胞,取对数生长期细胞,胰酶消化细胞,培养基中和,转移至离心管,低温超速离心后弃上清,PBS液清洗沉淀,RIPA裂解液裂解,充分裂解后,低温超速离心提取细胞蛋白。BCA法测定蛋白浓度,了解PZ蛋白是否在肺腺癌细胞高表达。第四部分Real time-PCR方法检测肺腺癌组织及癌旁组织的PZ m RNA表达情况实验分2组,5例正常肺组织和5例肺腺癌组织。-70℃冰箱取出标本,解冻,玻璃匀浆器匀浆,低温超速离心提取组织蛋白,BCA法测定蛋白浓度。最后进行数据统计分析,进一步证实PZ蛋白在肺腺癌中的表达情况及其与性别、分化及分期的关系。第五部分Real time-PCR方法检测正常支气管细胞及肺腺癌细胞PZ基因m RNA的表达实验分2组:正常支气管上皮细胞及肺腺癌细胞。培养正常支气管上皮细胞及肺腺癌细胞,取对数生长期细胞,提取总RNA,逆转录合成c DNA,RT-PCR仪检测各细胞PZ基因m RNA的表达量,数据统计分析,了解PZ m RNA在肺腺癌细胞中的表达情况。结果:第一部分PZ在正常肺组织、肺腺癌组织、肺腺癌旁正常组织的表达1.PZ在肺腺癌组织中高表达,在癌旁组织和正常肺组织中不表达或低表达,PZ在巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophages,TAMs)和新生血管的内皮细胞(Endothelial cells,ECs)中高表达。经统计分析可见PZ表达积分随肿瘤进展明显增高(P<0.05);另外,低分化组同中高分化组比较得出PZ表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.0005);不同性别对比,PZ表达无统计学差异(P>0.05)。第二部分Western blot方法检测肺腺癌组织、肺腺癌旁组织PZ蛋白的表达同肺腺癌旁组织相比,肺腺癌组织中PZ表达明显升高,且差异有统计学意义(P<0.0003);早、中、晚各组相互对比,经统计分析可见PZ表达随肿瘤进展明显增高(P<0.05);此外,低分化组同中高分化组比较得出PZ表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.0005);不同性别对比,PZ表达无统计学差异(P>0.05)。第三部分Western blot方法检测正常支气管细胞及肺腺癌细胞PZ蛋白的表达A549、212102、GLC-82及16-HBE-T中PZ蛋白的表达各有差异,经半定量密度分析得出PZ表达在A549、GLC-82呈高表达,在A549尤为突出,差异均有统计学意义第四部分肺腺癌组织和人正常肺组织PZ m RNA表达情况分别检测5例肺腺癌组织和5例正常肺组织PZ基因和管家基因GADPH表达情况。由于样本量不足,数据离散程度大,无统计学意义,后续需进一步加大样本量进行检测。(P>0.05)。第五部分正常支气管细胞及肺腺癌细胞PZ蛋白及m RNA的表达情况应用荧光定量PCR仪器SYBR方法分别检测肺腺癌细胞A549和正常细胞16-HBE PZ基因和管家基因GADPH表达情况,通过检测得出,肺腺癌细胞A549 PZ基因m RNA表达量与正常对照组二者之间的差异无统计学意义。结论:1.PZ蛋白在肺腺癌组中的表达明显高于正常肺组织(癌旁组织),表明PZ可能与肺腺癌的发生、发展相关。2.PZ蛋白在中晚期组的表达明显高于早期组,表明其表达可能与肺腺癌的分期相关,即肺腺癌越接近晚期,PZ蛋白表达可能越高。3.PZ蛋白在低分化组的表达明显高于中高分化组,表明其表达可能与肺腺癌的分化程度相关,即肿瘤的分化程度越低,PZ蛋白表达可能越高。4.PZ蛋白表达在性别组无统计学差异,可能表明PZ在肺腺癌的表达与性别无相关性。5.1)PZ蛋白在肺腺癌组织和肺腺癌细胞中的表达均高于正常肺组织和正常支气管上皮细胞。2)由于样本量不足,数据离散程度大,PZ m RNA在肺腺癌组织和正常组织中的表达无统计学意义,后续需进一步加大样本量进行检测。3)PZ m RNA在肺腺癌细胞和正常支气管上皮细胞中的表达量均较低,这种矛盾的结果,原因不明。