背景颅颌面部骨缺损是临床上常见损伤,也是骨科临床治疗的难题之一。近年来,骨组织工程发展迅速,利用骨组织工程治疗骨缺损成为研究的热点。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)对骨原细胞的分化起决定性作用,是促进成骨的重要因子之一。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,可促进新生血管形成。VEGF和BMPs的表达相互促进,并在骨再生过程中产生协同效应。构建BMPs和VEGF双基因修饰的组织工程骨,是促进骨缺损修复的一种有效方法。目的(1)探讨联合基因体外转染BMSCs修复颅骨标准骨缺损的可行性。(2)探讨BMP2和VEGF165二者在修复颅骨缺损中的协同作用。(3)比较BMP2和VEGF165单基因转染及联合基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)修复颅骨标准骨缺损的差异。方法(1)取羊骨髓,体外分离、扩增培养BMSCs,并应用流式细胞仪进行细胞鉴定。(2)采用阳离子脂质体转染BMSCs,按照BMP2和VEGF165联合基因转染细胞、BMP2单基因转染细胞、VEGF165单基因转染细胞、空质粒pIRES、未转染细胞分成五组,转染后RT-PCR检测各组BMSCs的BMP2、VEGF165基因的mRNA表达状况,Western-blot检测各组BMSCs的BMP2和VEGF165蛋白表达水平。(3)将转染后的各组BMSCs细胞接种到β-磷酸三钙(β-TCP)支架材料上,接种后第7天行环境扫描电镜观察,Hoechst比色法检测BMSCs在β-TCP支架材料上的增殖能力。(4)制作羊颅骨标准骨缺损模型,按分组将细胞支架复合物植入到颅骨缺损处,植入后12周、24周通过形态学观察、CT检查、组织学检查的方法检测颅骨缺损修复重建的效果。结果(1)经Western-blot和RT-PCR检测,外源性VEGF165及BMP2通过阳离子脂质体介导可成功转染BMSCs并表达相应的mRNA及相关蛋白。(2)细胞接种到支架材料后7天,扫描电镜观察发现细胞在支架材料上生长增殖良好。Hoechst检测表明接种后14天内各组细胞生长曲线无明显差异。(3)应用自体BMSCs复合β-TCP修复羊颅骨标准骨缺损,术后动物无明显不良反应,所有动物术后均存活,无感染发生。(4)植入后24周大体形态学、组织学和影像学检查表明,联合基因转染组和单用BMP2组有异位骨形成,联合基因转染组成骨面积多于单用BMP2组,其他各组均无成骨。结论(1)联合基因转染BMSCs可修复颅骨标准骨缺损,其成骨效果优于单用BMP2基因,而单用VEGF165基因不能诱导细胞支架复合物的体内成骨。(2)真核细胞表达载体(pIRES-BMP2-VEGF165、pIRES-BMP2、pIRES-VEGF165)转染使BMSCs中外源性BMP2、VEGF165得到表达,进而促进颅骨缺损的修复。(3)构建的重组质粒经脂质体系统体外转染BMSCs,细胞毒性低,不影响其在支架材料上的增殖和成骨分化。(4)通过重组质粒体外经脂质体转染羊骨髓间充质干细胞胞促进组织工程骨形成的研究,初步实现了从体外研究向体内研究的深入,并进一步阐明在新骨生成过程中,BMP2与VEGF165具有协同作用。