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细胞质雄性不育水稻根据遗传和细胞学特征分为野败(WA)、红莲(HL)和包台(BT)三大类型,其中红莲型水稻是武汉大学在上世纪70年代选育的配子体细胞质雄性不育类型,目前在生产上得到了大面积推广与应用。本论文对红莲型水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理进行了一些探索,获得以下研究结果：1.采用Northern blot、引物延伸、CR-RT-PCR和RACE的方法,我们系统地对红莲型CMS水稻不育系及其杂种F1代线粒体中不育相关基因的转录和转录后水平进行了细致的分析。并基于这些分子水平的结果将CMS红莲型和包台型水稻做了全面的比较分析。发现两者的不育相关区域atp6-orfH79和atp6-orf79,在不育系中的转录模式和杂种中恢复基因的加工位点等方面存在一些明显的差异：(1)对HL型CMS水稻的不育系不育相关区域的分析表明atp6-orfH79的基因间区域存在转录启动子。转录起始位点位于1117和1124,转录本长度分别为483bp和476bp。密度梯度离心实验证实这些新的转录本可能与核糖体共分离,推测其具有翻译能力。(2)对HL型CMS水稻杂种F1代(9311为父本)的分析表明9311中的恢复基因在atp6-orfH79共转录本上的加工位点有三个,其中一个位于atp6上游-11--13位,另外两个位于基因间区域的1132和1170位。(3)对33个含有atp6-orfH79同源片段的水稻基因型的聚类分析表明(基于非编码的基因间区序列比对),atp6-orfH79和atp6-orfH79分属两大类。2.为了深入研究红莲型水稻不育和育性恢复的分子机理,我们构建了红莲型水稻杂种F1的幼穗细菌双杂交系统文库。用Trizol试剂提取红莲型水稻杂种F1幼穗的总RNA,分离纯化mRNA后反转录并合成双链cDNA。经sephrose CL-2B凝胶过滤柱层析后,收集大于400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接到pTRG载体上,转化到XL1-Blue MRF’Kan感受态细胞后构建成红莲水稻幼穗细菌双杂交文库。经检测计算该原始文库容量为1.03×106pfu/mL,对随机挑取的100个克隆进行PCR鉴定,显示重组率接近100%,而且大于800 bp的插入片段达到97%。扩增后文库的容量达到1.05×1010pfu/mL。3.一些研究报道认为CMS的恢复基因可能是以复合体的形式发挥加工转录本的功能。为了搞清楚红莲型CMS恢复基因Rf5的恢复机理,我们对细菌双杂交文库淘洗的RF5可能的互作蛋白之一的GRP蛋白进行了详细的分析。(1)原核表达并纯化了RF5和GRP重组蛋白,并分别用圆二色谱对其二级结构进行分析,证明表达的重组蛋白具有典型的PPR和RRM基序所具有的二级结构特征。(2)凝胶阻滞和SPR(表面等离子共振)实验证明GRP蛋白能够与H-atp6的基因间区域的RNA相互作用而且分析了GRP蛋白与靶标RNA的结合常数等参数。酵母三杂交实验进一步将GRP与RNA的相互作用确定在两个较小的区段。