椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IVDD）是引起椎间盘突出、椎管狭窄、腰椎失稳等脊柱疾病的首要原因。随着我国社会人口老龄化,IVDD相关疾病的发病率不断上升。这不仅严重影响了广大患者的工作和生活质量,也为社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。目前,椎间盘突出的最有效治疗方法是去除突出的椎间盘、解除脊髓和神经根压迫。当前,针对IVDD的多种保守治疗与手术治疗策略尚不能作为治愈脊柱退变性疾病的完美方案。为了突破当前IVDD治疗修复的瓶颈,以微环境调理,基因转录表达干预、细胞移植和组织工程学为基础,致力于早期逆转IVDD病变的修复策略逐渐成为主流研究热点。在健康状态下,完整的椎间盘由纤维环和软骨终板包绕髓核,使得椎间盘内微环境处于免疫隔离的封闭状态。运动负荷所致的椎间盘微损伤会使该封闭状态被打破,进一步诱发级联炎症反应,最终导致髓核内环境紊乱。因此,炎症微环境是椎间盘内基质合成代谢与降解失衡的重要原因。在IVDD的早期病理变化中,髓核内环境的失衡造成了髓核细胞代谢异常,进而促使胞外基质蛋白聚糖和胶原蛋白降解,水分丧失,致使髓核逐步向纤维结缔组织转化。随着再生与免疫的相关性研究发展,以“诱导巨噬细胞发挥免疫调理作用”为核心思路的退变修复策略引起了广泛关注。作为机体重要的免疫调理细胞,巨噬细胞在免疫反应中发挥了多重调节作用。在不同细胞因子刺激下,巨噬细胞可根据微环境的不同做出相应的表型转化,这被定义为巨噬细胞极化。根据免疫调理功能的不同,巨噬细胞极化可分为:促炎的M1型与抗炎的M2型;后者还可进一步细分为发挥免疫调理的M2a型与参与组织重塑的M2c型。根据当前研究进展,M1型巨噬细胞的浸润与椎间盘退变呈正相关性。但考虑到M2极化的巨噬细胞在其他组织修复中的积极作用,该型巨噬细胞在椎间盘退变进程中是否发挥同样的正向促修复作用尚无定论。本研究的前期工作发现,将体外诱导而成的M2c型巨噬细胞与髓核细胞共培养可促进髓核细胞基质蛋白的表达分泌。基于该研究基础,本研究提出第一个研究假设:M2c型巨噬细胞可能通过调理髓核细胞基质代谢促进椎间盘退变修复。细胞间物质与信息交换是保持组织器官正常代谢功能、维持内环境稳定的重要生物活动。作为细胞间物质信息交换的主要载体,外泌体源自于细胞多囊泡体,是一种直径约30-100nm且具有双层磷脂膜的囊泡小体,其内包含多种蛋白质以及mi RNA、lnc RNA等非编码RNA。受到不同微环境刺激下,细胞可主动向间质内分泌外泌体,使其被其他受体细胞通过胞吞胞饮的方式吸收融合,以外泌体内含的多种生物活性为媒介向受体细胞传递调控信息,干预基因转录表达与相关信号通路的激活,进而影响受体细胞的增殖、迁移、分化、分泌、凋亡等生物学功能。因此,外泌体在一定程度上可以模拟来源细胞发挥微环境调理的功能。诸多研究发现,巨噬细胞来源外泌体在炎症调理,组织修复与肿瘤发生等病理生理过程中发挥复杂而多样的作用。基于上述理论与研究进展,本研究提出第二个研究假设:M2c型巨噬细胞可能通过分泌外泌体向髓核细胞内传递非编码RNA等活性物质,进而干预髓核细胞的代谢与活性。为论证上述两种假设,本研究首先原代培养大鼠M2c巨噬细胞,并建立M2c巨噬细胞与髓核细胞共培养体系,观察髓核细胞的增殖、迁移、基质蛋白分泌的表型变化,论证M2c巨噬细胞可调理髓核细胞代谢,向髓核基质退变修复表型转化;然后提取M2c巨噬细胞外泌体,论证该外泌体是否介导了M2c巨噬细胞对髓核细胞表型变化的作用,并明确M2c巨噬细胞外泌体的最佳作用浓度;随后,以透明质酸水凝胶为载体负载M2c巨噬细胞外泌体,并将其植入大鼠尾椎间盘退变模型中,体内验证该外泌体具有改善椎间盘退变的功效;最后,以蛋白质组学分析与生物信息学预测为基础,明确M2c巨噬细胞外泌体对髓核细胞表型干预的关键分子,建立并论证“外泌体mi RNA-关键蛋白-下游通路”的核心分子机制。第一部分M2c巨噬细胞对髓核细胞基质蛋白分泌的影响及初步机制探讨目的:体外诱导并鉴定巨噬细胞M2c极化;建立共培养体系探究M2c极化的巨噬细胞对大鼠髓核细胞增殖、迁移、基质蛋白与金属蛋白酶合成分泌的表型影响;提取并鉴定M2c巨噬细胞来源的外泌体,论证M2c巨噬细胞通过分泌外泌体干预髓核细胞的表型,并确定外泌体的最佳作用浓度。方法:1,骨髓巨噬细胞的原代培养与极化诱导:提取大鼠骨髓造血干细胞,采用鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导干细胞向巨噬细胞分化;采用细胞因子IL-10诱导巨噬细胞向M2c方向极化;以CD11b为巨噬细胞标志物,CD163为M2c极化标志物,采用免疫荧光染色与流式细胞技术,鉴定M2c极化的巨噬细胞。2,提取大鼠尾椎间盘原代培养大鼠髓核细胞。3,应用Transwell培养系统建立M2c巨噬细胞与大鼠髓核细胞的共培养体系,通过Ed U染色检测髓核细胞的增殖,通过结晶紫染色观察髓核细胞的迁移,应用免疫荧光染色与Western Blot检测髓核细胞II型胶原、蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13（MMP13）和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5（ADAMTS5）的表达。4,预先采用GW4869阻断M2c巨噬细胞的外泌体分泌,并在Transwell共培养下检测髓核细胞的增殖、迁移、基质蛋白与金属蛋白酶的分泌。5,采用超速离心法提取M2c巨噬细胞外泌体,采用透射电镜和NTA粒径分析观察外泌体形态,Western blot鉴定外泌体标志物（TSG101、CD9、CD63）。6,以不同浓度（0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml）的M2c巨噬细胞外泌体干预髓核细胞,检测髓核细胞的增殖、迁移、基质蛋白与金属蛋白酶的分泌。结果:1,流式细胞计数与免疫荧光染色均显示IL-10作用下的巨噬细胞高表达CD11b分子与CD163分子,说明M2c巨噬细胞极化诱导成功。2,与M2c巨噬细胞共培养后,Ed U染色与结晶紫染色显示髓核细胞的增殖与迁移显著增强,且II型胶原与蛋白聚糖的表达显著上调,MMP13与ADAMTS5表达显著下调。3,将GW4869预处理的M2c巨噬细胞与髓核细胞共培养,髓核细胞的增殖迁移仍被显著增强,与对照组（无预处理的M2c巨噬细胞共培养）无显著差异;但是,GW4869预处理后的M2c巨噬细胞对髓核细胞基质蛋白（II型胶原与蛋白聚糖）的表达促进作用与金属蛋白酶（MMP13与ADAMTS5）抑制作用显著低于对照组（无预处理的M2c巨噬细胞共培养）。4,通过超速离心法提取M2c巨噬细胞外泌体后,透射电镜显示外泌体形态完整,呈圆形,NTA粒径分析显示外泌体直径在30-150nm左右,Western blot显示外泌体标志物显著（TSG101、CD9、CD63）表达,说明M2c巨噬细胞外泌体提取成功。5.M2c巨噬细胞外泌体对髓核细胞的增殖迁移无显著促进作用,但该外泌体可显著刺激髓核细胞II型胶原与蛋白聚糖的表达,并抑制MMP13与ADAMTS5的分泌,且该效应在外泌体浓度为150μg/ml时达到最大。结论:M2c巨噬细胞可显著促进髓核细胞的增殖迁移,并显著刺激髓核细胞表达基质蛋白（II型胶原与蛋白聚糖）,抑制基质金属蛋白酶的表达（MMP13与ADAMTS5）。M2c巨噬细胞外泌体对髓核细胞的增殖迁移无显著作用,但仍可显著改善髓核细胞的基质代谢,促进II型胶原与蛋白聚糖表达,抑制MMP13与ADAMTS5分泌,且该外泌体的最佳作用浓度为150μg/ml。第二部分M2c巨噬细胞外泌体联合透明质酸水凝胶促进大鼠椎间盘退变修复的体内研究目的:以透明质酸（hyaluronic acid,HA）水凝胶为载体,向大鼠尾椎退变间盘局部植入M2c巨噬细胞外泌体,评价修复效果。方法:1,采用PKH26荧光标记M2c巨噬细胞外泌体（M2c-Exo）,并将其混入HA水凝胶,在不同时间点连续观察M2c-Exo从HA水凝胶内的释放情况。2,针刺法建立大鼠尾椎间盘退变模型,局部植入PKH26标记的M2c-Exo与负载该外泌体的HA水凝胶,采用小动物活体成像技术对比,在有无HA水凝胶装载条件下,M2c-Exo在大鼠尾椎间盘内的存活时间。3,构建大鼠椎间盘针刺退变模型,根据分组（sham假手术组、退变对照组、HA水凝胶组、M2c-Exo@HA水凝胶组）对尾椎进行相应干预,分别于术后4周、8周行小动物MRI、苏木精-伊红染色、番红O固绿染色与免疫组化染色（II型胶原与MMP13）,观察椎间盘MRI指数,组织学形态和椎间盘退变指数、II型胶原与MMP13表达情况。结果:1,在体外环境下,HA水凝胶可作为缓释载体连续释放M2c-Exo,并且可使M2c-Exo在大鼠尾椎间盘内的存活时间显著延长至21天。2,在干预后8周,M2cExo@HA水凝胶组的MRI指数、组织学形态和椎间盘退变指数、II型胶原的水平均显著优于损伤对照组与HA水凝胶组,MMP13的水平显著降低。结论:采用HA水凝胶作为载体可在体内缓释M2c-Exo,延长其作用时间。M2cExo@HA水凝胶复合体能在一定程度上改善退变间盘的组织学结构与影像学表现,促进II型胶原的表达,抑制MMP13的分泌。第三部分:M2c巨噬细胞外泌体通过mi R-124/CILP/TGF-β调控机制改善髓核细胞基质蛋白分泌目的:筛选并证明M2c-Exo对髓核细胞作用的关键分子:软骨中间层蛋白（Cartilage intermediate layer protein,CILP）;预测并论证靶向作用关键蛋白的M2c-Exo内mi RNA分子与关键蛋白的下游通路,明确M2c-Exo对改善髓核细胞基质代谢的分子机制。方法:1,采用4D-无标记蛋白组学技术（4D label-free proteomics,LFP）分析M2c-Exo作用下髓核细胞内差异表达蛋白,并分析其功能与信号通路富集,筛选M2cExo作用的关键蛋白CILP,并采用Western Blot加以验证。2,应用Targetscan数据库预测靶向作用CILP的M2c-Exo内mi RNA;采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription–polymerase chain reaction,RT-PCR）论证该mi RNA被M2c-Exo递送入髓核细胞;采用荧光素酶报告基因系统（Luciferase Assay）证明mi RNA可靶向结合于CILP的m RNA 3’端核酸序列。3,构建质粒载体,通过挽救实验证明M2c-Exo通过Mi RNA抑制髓核细胞CILP的表达,促进基质蛋白（II型胶原与Aggrecan）表达。4.通过Western Blot检测设计挽救实验,论证M2c-Exo通过调控CILP蛋白激活TGF-β/smad3通路,改善髓核细胞基质代谢。结果:1,4D LFP蛋白组学分析显示,M2c-Exo作用下髓核细胞内有74个蛋白表达上调,24个蛋白表达下调;并且,Gene ontology功能富集和KEGG信号通路分析显示差异蛋白与炎症调控、氧化应激、整合蛋白粘附、基质代谢、NF-κB通路、素蛋白酶体通路、HIF-1α通路相关。2,4D LFP蛋白组学以及Western Blot验证提示M2c-Exo作用下髓核细胞内CILP蛋白表达下调最为显著。3,应用Targetscan数据库提示mi R-124可靶向作用于CILP;RT-PCR结果显示mi R-124被M2c-Exo递送入髓核细胞内;荧光素酶报告基因结果显示mi R-124可靶向结合于CILP m RNA的3’端核酸序列。4,mi R-124 inhibitor作用下的髓核细胞蛋白聚糖表达下调,而ADAMTS5表达上调,并且该现象可通过M2cExo干预而解除。5,在M2c-Exo的干预下,髓核细胞内smad3磷酸化增强,而应用mi R-124 inhibitor转染解除髓核细胞内mi R-124对CILP表达的抑制作用后,过表达的CILP可显著抑制TGF-β诱导下的Smad3磷酸化,进而导致髓核细胞的基质蛋白分泌抑制和金属蛋白酶分泌增强。而采用M2c巨噬细胞外泌体干预髓核细胞,可逆转上述mi R-124inhibitor所致的Smad3磷酸化抑制和基质蛋白表达抑制。结论:M2c巨噬细胞外泌体对髓核细胞表型作用的关键分子是CILP。M2c巨噬细胞外泌体通过递送mi R-124抑制髓核细胞CILP蛋白表达激活TGF-β通路的分子机制调理髓核基质代谢,促进椎间盘退变修复。总结本研究论证了M2c巨噬细胞来源外泌体对髓核细胞基质代谢的正向调理作用;并且本研究采用组织工程学技术构建透明质酸水凝胶负载M2c巨噬细胞外泌体,发现M2c巨噬细胞外泌体可在体内显著改善大鼠尾椎间盘的退变。然后,本研究利用高通量蛋白组学技术及生物信息学预测,发现软骨中间层蛋白CILP是M2c巨噬细胞外泌体对髓核细胞表型作用的关键靶点分子,并通过mi RNA生物信息学预测与功能学验证,发现M2c巨噬细胞中的mi R-124可靶向结合蛋白CILP的m RNA末端序列,促进CILP m RNA的降解,从而抑制CILP在髓核细胞中的表达;最后本研究通过“挽救”策略试验发现,在M2c巨噬细胞外泌体作用下,髓核细胞内TGF-β/smad-3通路因CILP蛋白的抑制而被间接激活,从而促进了髓核细胞合成分泌II型胶原与蛋白聚糖。本研究建立了以“M2c巨噬细胞外泌体/mi R-124/CILP/TGF-β通路”为主线的髓核代谢调理与椎间盘退变修复机制,为免疫细胞来源外泌体联合组织工程技术调理椎间盘微环境、促进退变修复的策略研究提供了理论与实践基础。