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目的:1.根据课题组前期研究结果,柴胡皂苷a (SSa)、柴胡皂苷d (SSd)是柴胡总皂苷抗肝纤维化的物质基础,进而推测以接近内源性1:1的SSa、SSd是药效互补、药效协同的活性成分组合。本研究首先通过细胞实验和动物模型实验验证该推测的合理性。2.基于药效验证结果,依据SSa、SSd基本特性,设计并构建靶向星形细胞的SSa、SSd复方脂质体给药系统,完成复方脂质体制备技术研究,获得能降低溶血毒性、良好包封效果的脂质体给药系统。3.采用药代动力学及裸鼠活体成像评价复方脂质体给药系统的体内释药特征及靶向特性,评价构建复方脂质体的合理性。4.开展相关细胞实验进一步评价复方脂质体给药系统靶向HSC特性,及以脂质体给药系统为载体初步探明SSa、SSd组合物协同抗肝纤维化机制。方法:采用MTT法对不同比例SSa、SSd组合物抑制HSC-T6活性效果进行研究,优选组合物中SSa、SSd的比例;采用CCl4和DMN诱导的肝纤维化模型对一定比例的SSa、 SSd组合物抗肝纤维化效果进行验证,考察其协同作用;对SSa、SSd溶血性、油水分配系数、稳定性等参数进行测定;优选脂质体制备方法,采用P-B实验筛选影响脂质体成型的关键影响因素,再利用B-B实验优化各因素,获得理想的脂质体成型工艺;研究VA修饰的复方脂质体的制备工艺,并对VA的结合率进行评价;LC/MS/MS方法研究VA-SSa-SSd-Lip的药代动力学特性,小动物活体成像技术研究其靶向性;MTT实验研究不同脂质体对HSC-T6活化增殖的抑制作用;流式细胞实验研究VA-SSa-SSd-Lip诱导HSC-T6凋亡情况;Western Blotting实验研究VA-SSa-SSd-Lip对HSC-T6与肝纤维化相关的重要蛋白的表达影响。结果:1.SSa、SSd组合物协同抗肝纤维化作用研究。SSa、SSd对活化的HSC-T6细胞株增殖有明显抑制作用,不同浓度药物对活化表型的HSC-T6细胞株增殖呈现出不同程度的抑制作用,浓度越高其抑制效果越强;SSd对HSC的抑制作用明显强于SSa;不同比例SSa、SSd混合溶液对HSC的抑制作用不同,当SSa、SSd为1:2时其抑制作用最弱,2:1时次之,当其比例为1:1时最强,与SSd相当,甚至超过SSd;当SSa、SSd的浓度均为120μg·ML-1,对HSC-T6的抑制率为96.35%。从CCl4诱导的肝纤维化模型实验结果分析,SSa.SSd组的部分指标优于SSa组、SSd组,甚至优于阳性药对照组,SSd组与阳性对照药组效果相当,部分指标优于SSa组,初步证明SSa.SSd的联合应用有一定的协同作用。从猪血清诱导的肝纤维化模型实验结果分析,柴胡皂苷各组均可明显降低由猪血清诱导的模型大鼠肝脏系数,不同程度的改变血清及匀浆组织中HyP、HA、LA、TNF-α、TGF-β1、PDGF的含量,与其它给药组相比,SSa.SSd组大鼠的肝脏组织病变状况改善最明显,肝纤维组织增生减轻,肝纤维化面积减少,无假小叶形成。实验结果进一步证实了1:1的SSa、SSd组合物具有较显著的协同抗肝纤维化作用。2.依据SSa、SSd基本特性,设计并组装了VA-SSa-SSd-Lip。基本特性研究表明:(1) SSa、SSd均显示较强的溶血特性,且SSd溶血作用强于SSa; (2) SSa、SSd的油水分配系数表现为亲水亲脂性;(3) SSa、SSd在中性偏碱性环境下表现出较好的稳定性;上述研究为后续给药系统的设计提供依据。脂质体制备工艺研究结果为:(1) SSa、SSd复方脂质体比较适合采用薄膜蒸发法制备;(2)以包封率、溶血性、粒径等为指标,采用P-B实验筛选了三个重要影响因素,并利用B-B实验优化了三个工艺参数;(3)对B-B实验预测的理想值进行了实验验证;(4)通过对比VA的前插法和后插法两种方法,发现后插法对SSa、SSd的包封率没有影响,且VA结合率较高;(5)对VA-SSa-SSd-Lip冻干工艺进行了研究,优选了一元和二元冻干保护剂的种类和用量,制备了包封率高、稳定的VA-SSa-SSd-Lip冻干粉。3. LC/MS/MS法研究不同制剂药代特性结果表明,大鼠尾静脉注射SSa-SSd-Lip、 SSa-SSd-Sol和VA-SSa-SSd-Lip后,SSa、SSd的药动学行为基本相似,推测其原因可能是两者的结构及理化特性基本类似;给予SSa-SSd-Lip、VA-SSa-SSd-Lip后,SSa、SSd在体内的消除速率明显小于SSa-SSd-Sol,消除半衰期明显大于SSa-SSd-Sol,说明SSa-SSd-Lip、VA-SSa-SSd-Lip均有一定的缓释作用;对比SSa-SSd-Lip、VA-SSa-SSd-Lip发现,MRT、CL、AUC0-1、AUC0-∞基本相似,但VA-SSa-SSd-Lip的表观分布容积Vc值明显要小,提示VA-SSa-SSd-Lip可能具有更强的靶向性。裸鼠活体成像研究表明,注射生理盐水的空白组对裸鼠荧光测定无干扰;注射DiR-Sol不体现特定脏器的靶向性;而注射DiR-Lip和VA-DiR-Lip之后发现,裸鼠的肝区荧光强度明显要强于其他部位,且荧光在体内的存留时间明显要长于DiR-Sol,72小时之内在肝区均能检测到荧光:对比注射DiR-Lip和VA-DiR-Lip两种制剂,注射VA-DiR-Lip的裸鼠肝区于72小时仍能检测到比较强烈的荧光,而DiR-Lip的荧光强度则比较微弱;此外,注射VA-DiR-Lip后,其表现出肝区特征分布时间更短,说明其被肝区摄取更快,更具肝靶向性;从两者裸鼠荧光分布面积分析,在注射VA-DiR-Lip 12小时之后,荧光主要分布在裸鼠的肝区,其他区域基本检测不到荧光,而DiR-Lip裸鼠体内荧光分布面积明显要大于VA-DiR-Lip,说明其肝靶向性较VA-DiR-Lip差。4.MTT实验研究不同浓度的SSa-SSd-Lip、SSa-SSd-Sol和VA-SSa-SSd-Lip对HSC-T6活性的影响结果表明,它们对HSC-T6抑制强度存在剂量依赖性;在同等剂量对比可以得出,VA-SSa-SSd-Lip效果最强,SSa-SSd-Lip次之,SSa-SSd-Sol最弱;从作用时间分析,VA-SSa-SSd-Lip作用时间持续更长。流式细胞实验表明,各给药组较空白组有显著性差异;VA-SSa-SSd-Lip诱导HSC-T6凋亡效果与加入RBP量有关,加入量越大,效果越强;当加入RBPAb后,因其拮抗了RBP激活RBPR的作用,使其诱导HSC-T6的作用减弱;是否加入RBP、RBPAb对SSa-SSd-Lip的效果没有影响;Western Blotting对HSC-T6分泌的与肝纤维化相关的重要蛋白研究表明,SSa-SSd-Sol、SSa-SSd-Lip以及VA-SSa-SSd-Lip作用HSC-T648小时后,对CTGF、TGF-β1、α-SMA以及PDGF的表达均有抑制作用,其中VA-SSa-SSd-Lip作用最强,SSa-SSd-Sol最弱,SSa-SSd-Lip次之。CTGF、TGF-β1. α-SMA以及PDGF是活化的HSC-T6分泌的与肝纤维化相关的关键蛋白,VA-SSa-SSd-Lip通过抑制这些蛋白的表达来抑制HSC-T6的活性,发挥较好的抗肝纤维化作用。结论:通过上述研究,SSa、SSd (1:1)组合物协同抗肝纤维化作用得到了确认;获得了包封效果、稳定性良好的SSa-SSd-Lip, VA-SSa-SSd-Lip具有延缓药物释放、降低溶血毒性的作用,其靶向肝脏的功能在裸鼠动物模型中得到证实;通过体外细胞学实验,初步证实其具有靶向HSC-T6的作用;VA-SSa-SSd-Lip具有抑制HSC-T6活性及诱导其凋亡的作用,且对MAPK信号通路上与肝纤维化密切相关的重要蛋白表达有显著的干预作用,初步阐明了SSa、SSd抗肝纤维化作用机制。研究结果达到了预期目的。