出生缺陷被定义为一种先天性的新生儿的形态结构异常、生理功能异常或代谢缺陷,形态结构异常表现为先天畸形。据估计,大约有百分之三的美国新生儿被诊断为先天畸形。内科医生使用很多不同种类的药物用于治疗女性不孕,包括芳香酶抑制剂、二甲双胍、促性腺激素释放激素受体激动剂或拮抗剂,雌激素和孕酮,尽可能帮助不孕的夫妇孕育生命。与此同时,这些药物对新生儿的致畸作用也越来越引起人们的关注。克罗米芬柠檬酸钠是治疗女性不孕的常用药物。克罗米芬柠檬酸钠是两种异构体组成的外消旋体混合物。对于克罗米芬柠檬酸钠致畸毒性的研究结论一直存在很大争议。一些研究显示服用克罗米芬柠檬酸钠可以增加新生儿患神经管缺陷(NTD)的概率。然而,另一些研究的结论则表明孕妇服用克罗米芬柠檬酸钠和新生儿先天畸形不存在显著性联系。以斑马鱼作为模型研究药物发育毒性是一种新型的评价药物发育毒性的方法。斑马鱼具有其他体外细胞实验和动物模型所不能比拟的优势。首先,斑马鱼胚胎发育早期过程对于外界环境物质非常敏感。因此斑马鱼胚胎可以用于评价药物和环境毒物的发育毒性。并且,斑马鱼胚胎实验被认为是一种无痛的在体实验,不会受到伦理方面的限制。更重要的是,斑马鱼基因组与人类基因组高度同源,而且斑马鱼有与人类类似的解剖学和生理学特征,对外源性化学物质的反应也与人类非常相似。斑马鱼的形态学特征也使得其成为发育毒性研究的首选。斑马鱼胚胎透明,实验中可以直接观察胚胎发育的各个时期。最后,斑马鱼实验费用低,样本量大,实验耗时也大大减少。斑马鱼为模式生物应用于药物毒性试验和前期筛选越来越广泛,本文以斑马鱼为模式生物,研究克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼颅面部发育畸形的机制,同时也期望建立一种用斑马鱼模型简便预测药物发育毒性的方法。第一部分以斑马鱼为模式生物预测克罗米芬对哺乳动物的毒性目的:研究克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的半数致死浓度,评价斑马鱼模型对哺乳动物毒性数据预测的准确性。方法:采用寇氏法计算克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的LC50值,将所得结果与哺乳动物的半数致死量进行线性回归分析。结果:测定得克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼的LC50值为364.18 mg/L。且与大鼠的LD50值存在线性关系。结论:斑马鱼作为动物模型分析药物毒性,所需药物量少,且对哺乳动物的LD50具有良好的预测性。第二部分克罗米芬柠檬酸钠导致斑马鱼发育毒性的形态学变化目的:利用斑马鱼作为模式生物在形态学试验中的优势,研究克罗米芬柠檬酸钠对于斑马鱼胚胎发育的致畸毒性,以期得到较为直观的发育毒性效应。方法:斑马鱼胚胎分为4组,分别为对照组,浓度50,100,200 mg/L克罗米芬柠檬酸钠实验组,药物作用至受精后72小时停止。分别计算各组胚胎的孵出率,存活率,畸形率和心率;体视显微镜观察形态学变化,AO染色和Alcian-Blue染色后观察斑马鱼胚胎及幼鱼颅面部软骨发育异常和细胞凋亡情况。结果:相比于对照组,实验组的斑马鱼胚胎的孵出率,存活率,畸形率和心率均发生改变,200mg/L实验组中畸形率高达46±5.4%,而对照组的畸形率只有4.7±1.8%;体视显微镜观察显示实验组斑马鱼胚胎发育形态学都有所改变,200 mg/L实验组畸形最为严重;AO染色显示50 mg/L和100 mg/L实验组细胞调亡现象并不明显;200mg/L组有细胞凋亡现象发生;Alcian-Blue染色显示实验组斑马鱼颅面部软骨发育异常。结论:克罗米芬柠檬酸钠可以导致斑马鱼胚胎发育过程中软骨发育异常,并在药物浓度较高时有细胞凋亡现象发生。因此克罗米芬柠檬酸钠可能与斑马鱼胚胎发育畸形相关。这一结论与应用其他模式生物进行克罗米芬发育毒性研究所得结论相一致。因此,斑马鱼作为模式生物研究化合物的发育毒性,结果直观,便于观察,并具有良好的预测性。第三部分克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼颅面发育相关基因表达的影响目的:研究克罗米芬柠檬酸钠对斑马鱼颅面部发育相关基因表达的影响。同时也希望以斑马鱼为模型,建立一种研究药物发育毒性的便捷方法。方法:斑马鱼胚胎分为3组,分别为对照组,克罗米芬柠檬酸钠50,100mg/L实验组,进行作用至受精后48小时停止。采用荧光定量PCR法对fox1、mmp13、bmp2、msx1和p53等与颅面部发育密切相关的基因的表达变化进行测定。结果:与对照组相比,克罗米芬柠檬酸钠作用后,fox1 mRNA的表达下降,并且在不同作用时间点呈现相同趋势;mmp13、bmp2和msx1 mRNA的表达量升高,不同作用时间其变化趋势相同;p53 mRNA的表达在药物作用24小时后明显下降,在48小时点表达有轻微上调,但与对照组相比不具有显著性差异。结论:克罗米芬柠檬酸钠引起fox1、mmp13、bmp2、msx1和p53表达水平变化,斑马鱼颅面部发育异常可能与这些基因的表达失调有关。同时,斑马鱼与哺乳动物的蛋白质结构功能的高度同源性,使得斑马鱼研究所得数据可以有效预测研究药物对人类的发育毒性和药物安全性。