肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性疾病之一。肺癌在我国的5年生存率仅为16.1%,但若能早期发现并及时进行手术治疗,其5年生存率可提高至60～80%。根据临床病理学特征,肺癌又可分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌,其中约80%的临床患者为非小细胞肺癌,但只有约为30%的病人可被诊断为早期患者,并可通过手术完全切除;剩余的70%晚期患者只能通过化疗等手段治疗,但预后极差。因此寻找非小细胞肺癌有效的早期诊断指标以及有效的治疗靶点显得尤为重要。最近的研究发现,Anterior gradient-2(AGR2)作为一个新的原癌基因在非小细胞肺癌组织中高表达,且为分泌蛋白,在肺腺癌的早期诊断中更具有敏感性,因此AGR2蛋白可作为非小细胞肺癌的一个新的诊断和治疗靶点。AGR2基因,位于人染色体7p21.3,在各种组织细胞内广泛分布。AGR2有独特的一级蛋白结构,既存在分泌信号也含有内质网滞留序列,而且还存在蛋白二键异构酶活性位点和reptin蛋白结合序列,赋予了了 AGR2在细胞内多样化的作用。近几年关于AGR2在多种肿瘤组织中的表达情况、在肿瘤的发生及恶性表型中的作用等报道较多,研究表明,AGR2可促进肿瘤细胞的存活、促进肿瘤侵袭转移等。但AGR2为何在多种肿瘤中高表达、在肿瘤细胞中的表达调控机制等尚不十分明确。我们课题组通过前期的药物筛选发现,蛋白酶体抑制剂MG132可显著下调AGR2的蛋白水平,蛋白酶体可以通过降解泛素化的受损变性蛋白、短寿命的调控蛋白等,调控细胞周期、凋亡与分化、信号转导等生理过程。因此蛋白酶体被抑制后会引起短寿命的调节蛋白如p53,p21的表达升高,同时也会代偿性地激活自噬途径来降解细胞内堆积的错误折叠蛋白。本论文首先分析AGR2在肺癌中的表达情况,并探讨抑制蛋白酶体活性后AGR2表达下调的分子机制。结果:第一部分AGR2在肺癌中的表达与预后的关系1.AGR2在非小细胞肺癌中高表达。我们通过已有的肿瘤基因数据库如TCGA,oncomine等来研究AGR2蛋白在非小细胞肺癌中的表达情况,结果发现肿瘤组织的AGR2表达要比正常的肺支气管上皮组织高2倍以上,同时我们利用NCI-60数据库发现其内的非小细胞肺癌细胞系AGR2的拷贝数都在2N以上,因此AGR2基因非小细胞肺癌组织中是高表达的。2.AGR2蛋白影响细胞生存,其表达高低影响非小细胞肺癌患者的预后水平。由于AGR2在非小细胞肺癌中高表达,我们利用针对AGR2的siRNA来敲低非小细胞肺癌细胞系中AGR2的蛋白水平后,光镜结果显示敲低AGR2蛋白后,细胞生长明显放缓,MTT结果也同样证明这一结果。同时我们利用TCGA数据库分析了非小细胞肺癌患者在化疗之后的生存率,其结果表明AGR2蛋白表达高的患者其生存率明显降低。第二部分抑制蛋白酶体活性下调AGR2表达的分子机制1.MG132下调AGR2在非小细胞肺癌的表达。前期的基因表达差异谱芯片结果显示,蛋白酶体抑制剂MG132可显著降低非小细胞肺癌A549细胞中AGR2的表达。我们首先利用western blotting和定量PCR实验进行验证,发现MG132显著下调A549细胞中AGR2的mRNA和蛋白水平,并且表明MG132可在转录水平抑制AGR2的表达。同样,细胞转染实验结果显示,MG132可以显著抑制AGR2启动子(1.4Kb)或核心启动子(含0.5kb的启动子序列)的活性。浓度梯度实验结果显示,低剂量(1uM)的MG132可显著下调AGR2蛋白的表达,而蛋白酶体的底物蛋白p53和p27的水平随着作用时间的延长持续升高,表明此浓度的MG132可显著抑制蛋白酶体活性。更为重要的是,MG132在此浓度下并无显著的诱导细胞死亡的作用。因此AGR2蛋白的下调并非MG132诱导的细胞死亡所致。2.MG132诱导的内质网应激和ROS水平升高不参与AGR2的表达调控过程。抑制蛋白酶体活性可导致错误折叠蛋白的降解受阻、诱导内质网应激和ROS水平升高,二者可通过不同的机制调节某些应激蛋白的表达来抵抗外界环境的对细胞的影响。AGR2作为内质网的二硫键异构酶,其表达是否受内质网应激的调控?(1)MG132可显著诱导内质网应激,下调AGR2的表达:MG132使内质网应激的标志蛋白GRP78的表达持续增加,p-eIF2α(失活形式)的表达也呈现同样的趋势,但eIF2 α的总蛋白并未发生变化,表明MG132的确可诱导内质网应激。(2)缓解内质网应激并不逆转MG132下调AGR2的表达:western blotting结果显示,当有内质网应激抑制剂存在时,并不影响MG132对AGR表达的抑制作用。同样,p-eIF2 α去磷酸化抑制剂Salubrinal也不逆转MG132对AGR2表达的调控作用。(3)经典的内质网应激诱导剂增加AGR2的表达:衣霉素(TM),类毒胡萝卜素(TG)是经典的内质网应激诱导剂,western blotting和定量PCR结果显示,这2个抑制剂在转录和蛋白水平均可诱导AGR2的表达,且随着作用时间的延长,AGR2的表达持续增加,其结果与MG132的结果相反,表明内质网应激并非是MG132下调AGR2表达的主要机制。(4)MG132诱导的ROS不参与其对AGR2的表达调控:流式结果显示,MG132以时间依赖性的方式提高细胞中的ROS水平,而细胞中ROS水平显著增加的同时,AGR2的表达却显著下调。我们进一步用抗氧化剂NAC来降低细胞内MG132诱导产生的ROS,然而MG132对AGR2表达的调控作用并未受到影响。因此,MG132引起的内质网应激和ROS在AGR2的表达调控过程中并不发挥重要作用。3.E2F1和p65可上调AGR2的表达,MG132通过抑制E2F1的表达来降低AGR2的转录。由于MG132可在转录水平下调AGR2的表达,我们进一步分析AGR2启动子区域的转录调控位点。已有研究报道,激素,转录因子FOXA1,FOXA2,雄激素受体(AR)都可正向调控AGR2的表达。我们利用Genomatix软件,分析AGR2启动子区域转录因子的结合位点,时发现除上述转录因子外,其启动子区分别有一个经典的转录因子E2F1和p65的结合位点。,前期的数据表明MG132并不影响FOXA1,FOXA2的表达。(1)E2F1和p65可以正向调控AGR2的转录。RNA干扰实验结果显示,下调E2F1和p65可显著降低AGR2的mRNA和蛋白水平,同时双荧光报告基因结果显示E2F1和p65可以显著增强AGR2启动子的活性,表明E2F1和p65是AGR2的正调控因子。(2)MG132下调E2F1、AR的表达:定量PCR和Western blotting结果显示,MG132可在转录水平显著下调转录因子E2F1、AR的表达。(3)p65和AR不参与MG132对AGR2的表达调控:western blot结果显示MG132并未降低p65的表达,但可显著增强P-p65(ser573)的水平,因此MG132对AGR2的调控可能不受p65的直接控制。同时RNA干扰实验结果显示,下调AR可轻微降低AGR2的表达,表明AR可正调控AGR2的表达。但过表达AR后,并未逆转MG132在转录水平对AGR2抑制作用,因此,AR并不是MG132对AGR2的转录调控的关键因子。(4)MG132可通过下调E2F1抑制AGR2的转录:通过基因转染E2F1的表达质粒,发现过表达E2F1可部分逆转MG132引起的AGR2的mmRNA下调。报告基因结果显示,过表达E2Fl可提高含有E2F位点的AGR2启动子活性,并部分逆转MG132对AGR2的抑制作用。因此,E2F1在MG132引起的AGR2转录抑制中具有重要的调控作用。4.MG132诱导的自噬可促进AGR2蛋白降解。(1)MG132显著降低AGR2的蛋白水平:蛋白合成抑制剂(CHX)可以抑制AGR2的翻译,western blotting结果显示,在CHX存在的情况下,MG132依然进一步降低AGR2蛋白水平,表明MG132不仅在转录水平抑制AGR2的表达,还可促进AGR2的蛋白降解,致使AGR2的蛋白水平显著降低。(2)MG132诱导细胞发生自噬:测AGR2蛋白的半衰期发现,AGR2蛋白半衰期在24h左右,而半衰期大于5h常被认为是长寿命蛋白,可通过自噬途径降解。研究已证实,蛋白酶体活性被抑制后会代偿性的引起自噬,从而使累积的泛素化蛋白被降解。Western blot和免疫荧光结果显示,MG132可诱导自噬标志性蛋白LC3B的表达以及LC3B-I向LC3B-II的转变,并诱导聚集的LC3荧光斑点。(3)MG132诱导的自噬促进AGR2蛋白降解:Western blotting结果显示,MG132能够以时间依赖性的方式显著提高LC3BII的表达,而AGR2蛋白水平随着LC3BII表达的升高而降低。免疫共沉淀实验表明,MG132处理细胞后,泛素化的AGR2蛋白显著累积,这些结果提示,MG132诱导的自噬可能促进了泛素化AGR2蛋白的降解。我们利用激光共聚焦分析LC3B和AGR2的共定位情况,结果显示,在A549细胞中共转染了 pmCherry-AGR2和pEGFP-LC3表达质粒后,具有红色荧光的AGR2蛋白可与绿色的LC3斑点共定位。综上,MG132引起的自噬可能促进AGR2蛋白的降解。(4)AGR2蛋白可通过自噬途径降解:为了进一步分析自噬对AGR2蛋白的降解作用,我们利用经典的自噬诱导剂雷帕霉素诱导细胞产生自噬,发现雷帕霉素显著升高LC3BII,并降低p62蛋白(自噬的底物之一)的同时,使AGR2蛋白也随之降低。而采用自噬抑制剂3-MA,氯喹(CQ)降低MG132诱导引起的自噬水平,也同时抑制AGR2蛋白的降解。另外,利用siRNA特异性的降低自噬关键基因ATG5、ATG7的表达,均可显著抑制LC3B的表达来抑制自噬,同时显著逆转MG132引起的AGR2蛋白水平的降低。上述结果表明,AGR2蛋白可通过自噬途径发生降解。(5)细胞自身的的自噬水平与AGR2的蛋白水平呈负相关:我们对6种肺癌细胞株的自噬和AGR2表达水平进行分析,western blotting结果显示,AGR2的蛋白水平与细胞的自噬水平呈现负相关。当在自噬水平高的细胞株HBE和H1688细胞中加入自噬抑制剂氯喹(CQ)时,AGR2的蛋白水平会显著恢复。另外,利用Pubmed数据库,我们同时比较了 AGR2和自噬相关蛋白p62在非小细胞肺癌组织和正常肺组织的表达差异,结果表明,AGR2和p62的表达在非小细胞肺癌中均为高表达,因此AGR2蛋白在非小细胞肺癌中的高表达可能与其自噬水平较低有关,进一步证实自噬可促进AGR2的蛋白降解。结论:1.蛋白酶体抑制剂MG132可显著在转录和蛋白水平下调AGR2的表达,AGR2的下调并非MG132引起的细胞死亡所致,而是依赖于MG132对蛋白酶体活性的抑制作用。2.MG132抑制蛋白酶体活性所引起的内质网应激和ROS并不参与调节AGR2的表达。3.转录因子AR和p65可调节AGR2表达但并不参与MG132对AGR2的表达调控过程,而转录因子E2F1可以正向调节AGR2的表达,MG132可通过抑制E2F1的表达、在转录水平下调引起的AGR2表达。4.MG132还可显著促进AGR2的蛋白降解,此过程是由于MG132抑制蛋白酶体活性后可显著诱导肺癌细胞发生自噬,促进泛素化AGR2的降解。并通过细胞和临床样本数据证实,细胞内的自噬水平与AGR2的表达呈负相关。创新点与不足之处:1.首次报道MG132抑制AGR2的表达,并且MG132可在转录和蛋白降解两个方面对AGR2的表达水平进行调控;首次报道转录因子E2F1和p65可以调节AGR2转录并且E2F1可参与MG123对AGR2表达的调节,然而E2F1并不能完全逆转MG132所介导的AGR2的转录下调,因此是否存在其他转录因子或机制参与AGR2的调节尚需进一步研究。2.首次报道通过自噬-溶酶体途径可降解泛素化的AGR2蛋白,并且AGR2的蛋白表达与自噬水平具有显著的负相关性,但参与AGR2蛋白降解的自噬相关受体及机制尚需进一步研究。