论文部分内容阅读
脂质是鱼类生长发育过程中重要的营养物质之一,也是鱼类获取能量和必需脂肪酸的主要来源。然而,高脂饲喂会导致过量的脂肪酸被转换成甘油三酯并以脂滴的形式储存在非脂肪组织中,如肝脏、肌肉和肾脏,最终导致营养代谢性疾病。鱼类的肾脏相当于哺乳动物的骨髓,是重要的免疫器官。因此,研究不同类型脂肪酸在肾脏细胞的脂质代谢平衡的改变,进而对机体代谢性疾病的发生发展具有重要意义。含水解酶域蛋白5（α/βhydrolase domain containing 5,ABHD5）属于α/β水解酶折叠家族,是体内重要的脂滴相关蛋白,其通过与ATGL或其他脂滴蛋白（PLIN5或PLIN1）之间相互作用在脂滴的稳定性和代谢过程中发挥非常重要的作用,也可以调控自噬和炎症等生理过程。但是其在草鱼体内的具体作用尚不明确。本研究中,利用油红O染色、免疫荧光染色、RT-q PCR、Western Blot、Co IP和RNA-seq等技术,克隆获得了ABHD5基因,并研究了不同类型脂肪酸对ABHD5基因表达的影响,及PA调控ABHD5表达所涉及的信号通路,着重阐明ABHD5在脂肪酸诱导的脂质积累中的调控作用。获得的主要结果如下:1、ABHD4和ABHD5基因的克隆和生物信息学分析。结果显示:ABHD4（Gen Bank登录号:MK645600）基因全长c DNA序列,长度为1662 bp,编码366个氨基酸;ABHD5（Gen Bank登录号:KP325482）基因全长c DNA序列,长度为1035 bp,编码344个氨基酸。蛋白结构域预测显示,ABHD4和ABHD5含有α/β水解酶结构域。多重序列比对显示,ABHD4和ABHD5氨基酸序列与其他物种之间分别有58.61-98.09%和60.97-93.31%的序列一致性。系统进化分析显示草鱼ABHD4和ABHD5其他鱼类聚为一类,其次与哺乳类聚为一支。RT-q PCR结果显示ABHD4和ABHD5 m RNA在所检测的14种不同组织中均有表达。2、基于RNA-seq的ABHD5调控靶基因的筛选与验证。构建ABHD5过表达载体瞬转CIK细胞,运用RNA-seq测序分析ABHD5对CIK细胞的影响。GO富集分析发现差异基因主要涉及代谢过程、定位、细胞过程、发育过程和生物过程的调节等。KEGG富集显示差异基因涉及内质网内蛋白加工、鞘脂代谢、凋亡及TNF信号通路等生理进程。RNA-seq测序结果显示:鉴定出1105个差异表达基因,其中下调482个,上调623个。其中上调的基因包括ATGL、AGPAT9、ATP5G3、ANXA2和Smad7等,并通过RT-q PCR验证了这些差异基因的表达。蛋白互作数据库STRING预测发现,ABHD5与AGPAT9之间存在相互作用。这些结果表明ABHD5可能影响ATGL和AGPAT9的表达。3、ABHD5调控ATGL的表达并诱导脂解。结果表明:免疫荧光结果显示ABHD5蛋白在CIK和COS7细胞中均有表达。过表达ABHD5能够增加ATGL基因的m RNA和蛋白表达。Co IP结果显示ABHD5与ATGL并无直接结合。此外,ABHD5过表达增加ATGL蛋白表达,并降低FAs诱导的甘油三酯含量。这些结果表明ABHD5能够诱导ATGL表达且具有促进脂解的作用。4、不同脂肪酸对CIK细胞内ABHD5表达的影响。结果显示:相对于棕榈酸（Palmitic acid,PA）,油酸（Oleic acid,OA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）能够显著诱导CIK细胞内脂滴的生成。同时,PA显著诱导ABHD5和内质网应激相关基因（GRP78、CHOP、ATF6、IRE1α和IRE1β）的表达。而且,一定浓度的OA或DHA减弱了PA诱导的ABHD5的表达和增加了脂滴的积累。同时,减弱了内质网应激和自噬相关基因的表达。这些结果表明ABHD5的表达与PA诱导的内质网应激紧密相关。5、IRE1α-XBP1信号通路涉及PA诱导ABHD5的表达。结果显示:成功克隆获得IRE1α（Gen Bank登录号:MH370854）和IRE1β（Gen Bank登录号:MK616212）基因全长c DNA序列,分别编码1031和944个氨基酸,均包含有信号肽、Ser/Thr蛋白激酶和RNase结构域。不同浓度毒胡萝卜素（内质网应激诱导剂）可以显著增加内质网应激相关基因（IRE1α、IRE1β、GRP78、CHOP和ATF6）的m RNA表达,同时显著上调ABHD5的表达。加入4-PBA或4μ8c后,显著降低PA诱导的ABHD5及GRP78、CHOP和ATF6的表达。过表达XBP1s显著增强PA诱导ABHD5的表达。这些结果表明IRE1α-XBP1通路介导了PA诱导ABHD5的表达。6、ABHD5稳定细胞株的构建及对AGPAT9表达的影响。结果显示:构建ABHD5慢病毒载体,成功包装ABHD5慢病毒,并构建了稳定表达ABHD5基因的COS7细胞株。克隆获得了AGPAT9（Gen Bank登录号:OK044146）和AGPAT9L（Gen Bank登录号:OK044147）基因全长c DNA序列,分别编码450和444个氨基酸,均包含有三个跨膜和PIs C结构域。RT-q PCR检测发现,OA和DHA能够显著诱导AGPAT9和AGPAT9L表达,但PA能够剂量依赖性地下调它们的表达。此外,过表达ABHD5增加了AGPAT9的表达。表明ABHD5能够调控AGPAT9的表达而影响脂质代谢。综上所述,本研究首次克隆获得了草鱼ABHD4和ABHD5的c DNA序列。系统研究了不同类型脂肪酸（PA、OA和DHA）对CIK细胞内质网应激和ABHD5表达的影响,并明确了PA通过IRE1α-XBP1s信号通路对ABHD5的表达进行调控。过表达ABHD5增加ATGL表达而促进脂解,也可增加AGPAT9表达而影响脂质代谢。这些研究为更好阐明ABHD5在不同脂肪酸诱导的脂质代谢变化过程中的作用提供了参考。