海洋生物体内通常含有大量的脂肪。如一些高纬度的浮游动物,体重的2/3是脂肪,大多数是蜡酯(Wax ester)。Capelin体内也具有20%的脂肪,以甘油三酯为主。鳕鱼和三文鱼摄食这些浮游生物,因此体内储藏大量的脂肪。鱼类对脂肪的、吸收和代谢与陆生动物类似,但不同种类鱼类消化系统有结构上的差异,也使得其吸收代谢有差异。消化鱼类对饵料中脂肪的消化吸收率高达95%,通过肠道中的脂肪酶对脂肪进行分解。鱼类的脂肪分解酶通常存在于消化道的前段或胃幽门中,但有时也出现在肠道后段。胰脏和肝胰脏是合成脂肪酶的主要场所,同时肠道黏膜和胃也是脂肪酶的合成地点。鱼体内的脂肪消化酶主要有以下几种:甘油三酯酶(Triacylglycerol Lipases);磷脂酶(Phospholipases);其它的脂肪分解酶;固醇酯水解酶(cholesteryl ester hydrolase)。吸收脂肪水解产物为脂肪酸,还有一些甘油酯,主要为2-甘油单酯。甘油三酯的水解产物为甘油二酯和甘油,磷脂甘油的分解产物为1-acyl-lyso- glycerophospholipid,胆固醇酯和蜡酯的水解产物为胆固醇和长链醇。脂肪水解产物由胆汁酸盐胶团(bile salt micelles)溶解或乳化,通过肠黏膜渗透进入细胞。在肠黏膜细胞中,吸收的脂肪酸重新酯化成为甘油,甘油酯和lyso- glycerophospholipid,再形成甘油三酯和磷脂甘油。固醇和蜡酯也能部分重新合成,游离胆固醇能轻易通过肠黏膜细胞,脂肪醇氧化成相应的脂肪酸。而1-acyl-lysoglycerophospholipid也在输出肠细胞前重新合成磷脂甘油。转运脂肪通过脂蛋白从肠道转运到体内各处。鱼体内存在5种脂蛋白,分别是脂肪微粒,极低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白和极高密度脂蛋白。脂肪转运至周围组织后,脂蛋白酯酶(LPL)断开酯键,脱下脂肪酸进入细胞。通常有两种方式将脂肪酸转运入细胞,一种是扩散作用,另一种是通过FAT (fatty acid translocase)和FABP(fatty acid binding protein)将脂肪酸带入细胞。代谢脂肪是鱼类的重要能量来源。红肌,肝脏和心脏通常被认为是鱼类脂肪酸β——氧化的重要场所。鱼类对脂肪酸的代谢还受到鱼个体大小,生命周期和季节等因素的影响。关于鱼类β——氧化的过程简而言之,脂肪酸在ATP和CoA,以及Acyl-CoA syntethase的作用下,形成Acyl-CoA,进入过氧化酶体或线粒体内进行β——氧化。Carnitine palmitoyl transferase-Ⅰ(CPT-Ⅰ)在线粒体外膜处将Acyl-CoA转化为Acyl-carnitine,进入线粒体内膜完成β——氧化。CPT-Ⅰ通常被认为是主要限速酶,另外CPT-Ⅱ在此过程中也具有重要的调节作用。合成脂肪生成(Lipogenesis)主要指合成内源性脂肪的过程。碳水化合物代谢产物丙酮酸或某些氨基酸形成的碳源——乙酰CoA在线粒体中形成新的脂肪。主要的合成途径,细胞质的脂肪酸合成酶(FAS)复合酶系已经在鱼类上得到肯定。该途径的主要产物是16:0和18:0,1个乙酰-CoA的前体,加上7个乙酰形成16:0,该过程需要NADPH。其它的合成途径是产生NADPH的过程,包括PENTOSE PHOSPHATE PATHWAY (PPP)和柠檬酸脱氢酶。鱼类中主要产生NADPH的酶为Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)(Dias et al.,1999)。通常情况下,海水鱼的食物链能提供大量的脂肪酸,因此海水鱼的内源性合成脂肪的量很低,而淡水鱼由于食物中缺少脂肪,所以具有很强的脂肪生成能力,而且饵料中的营养因素对脂肪生成的影响也很大。所有生物,包括鱼类,都能去饱和16:0和18:0,生成16:1-9,16:1-7和18:1-9。关于鱼体内单不饱和脂肪酸延长的机制目前还不太清楚,但许多鱼类,在其天然饵料中有丰富的脂肪酸,因此这种内源性脂肪酸的生成能力并不太强。前言养殖鱼类肝脏脂肪大量蓄积的现象,通常被称为脂肪肝,早已被人们观察到并进行了相关的研究(Mccain 1977;Pierce 1980;Fluchter 1982;Storch 1983)。鱼类出现脂肪肝症状后,肝脏发生了一系列的病理学变化,这些变化主要集中在以下几个方面:1、肝脏理化性状的改变肝脏出现脂肪肝症状时,从外观看来,普遍发生肝脏颜色变浅、变黄、花斑等现象(Pierce 1980;Kranz 1985;Penrith 1994)。肝脏密度因为脂肪含量不同也发生了变化,正常鱼肝脏放入固定液中是沉在水底,而脂肪含量较高的肝脏则浮在其中(Tucker 1997)。2、肝脏细胞结构的变化Kranz(1985)年在他的文章中详细描述了德国Elbe河口高污染区的ruffe(Gymnocephalus cernua)肝脏脂肪蓄积的现象以及肝细胞的变化。在光镜下,呈现全部发白或淡黄色的病鱼肝细胞中有大量的空泡,这些空泡是在制作肝组织切片时,脂肪被去除后留下的。随着脂肪沉积量的增加,一些小的空泡会相互合并形成大的空泡,肝细胞也会膨胀为正常肝细胞的2——2.5倍,细胞核被挤到细胞的边缘,周围的血管也萎缩了。脂肪肝中通常还有黑色巨噬细胞出现。3、肝细胞器的变化Braunbeck(1990)详细描述了由于lindane污染造成的斑马鱼(Brachydanio rerio)脂肪肝,其肝细胞器的变化。当水体中lindane量在40ug/L时,斑马鱼肝脏中脂肪含量明显上升。肝细胞直径由于脂肪蓄积而增大, Lindane还造成斑马鱼肝细胞粗面内质网的有序排列被破坏。随着粗面内质网腔的不断增大,脂肪滴的数量和体积也在急剧增加。其它的细胞器没有显著的变化,只有线粒体被观察到呈方形。随着鱼类肝脏中脂肪量的增加,肝脏脂肪酸组成,代谢酶的活性,抗氧化系统以及相关基因都发生了不同程度的变化。关于养殖鱼类脂肪肝的成因,有多种不同解释,基本原因归纳如下:1、疾病造成的脂肪肝生产中很多患病鱼通常都伴随有脂肪肝的发生(Brenden 1986,Waagbo 1988)。2、环境污染或有毒有害物质造成的脂肪肝肝脏是鱼类重要的解毒器官,环境中过量的重金属、农药残留等污染往往破坏了肝脏的结构和功能,造成鱼类肝脏脂肪沉积。3、营养因素造成的脂肪肝鱼类摄食的糖或脂类过量,都有可能造成肝脏脂肪的大量蓄积。实验在海水网箱养殖的大黄鱼中,脂肪肝是一种严重致死性的常见疾病。本实验的主要目的是研究大黄鱼肝脏结构和脂肪酸组成的变化对其产脂酶和抗氧化酶活性的影响。2003-2004年夏季期间,实验大黄鱼在中国东海取样,实验鱼平均体重为180±20克。实验鱼肝脏根据不同脂肪沉积程度分为3种:正常肝脏,轻微脂肪沉积肝脏,脂肪严重沉积肝脏,分别进行肉眼和组织学观察。并测定肝脏脂肪酸组成和相关代谢酶和抗氧化酶活力的测定也分别进行。其中脂肪提取采用Folch (1957)的方法;脂肪酸的制备采用Ackman (1998)的方法;6PGDH (EC 1.1.1.44)采用Chou (1996)的测定方法;G6PDH (EC 1.1.1.49),ICDH (EC 1.1.1.42)采用Methods of Enzymatic Analysis的方法; Glutamic-oxaloacetic transaminas (GOT, EC 2.6.1.1), glutamic-pyruvic transaminase (GPT, EC 2.6.1.2), superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), malondialdehyde (MDA)使用商业试剂盒测定(试剂盒购自南京建成生物技术公司);蛋白含量的测定采用Lowery的方法( 1951)。数据统计使用SPSS 10.0的Duncan’s多重比较, P<0.05为差异显著。光镜观察结果显示,正常大黄鱼肝脏为深红色,正常的两叶型,光镜下能清楚看到肝细胞,肝小管及其分支。具有轻微脂肪肝症状的大黄鱼肝脏,虽然还能保持正常的两叶型,并能分辨出肝小管及分支,但肝脏颜色已呈现淡粉红色,光镜下能观察到肝细胞中出现的脂肪小泡。具有严重脂肪肝症状的大黄鱼肝脏,颜色为淡黄色到白色,肝脏肿胀,光镜下能观察到大量的脂肪或糖原空泡充斥肝脏内部,肝小管已不能清晰观察到,肝细胞也因为大量脂肪的沉积而变大膨胀。实验结果显示,随着大黄鱼肝脏脂肪含量上升,饱和脂肪酸和n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)含量显著降低,然而单不饱和脂肪酸和n—6多不饱和脂肪酸(n-6 PUFA)含量上升。n-3/n-6的比例在正常肝脏中最高,在轻微脂肪肝中降低了约4倍,严重脂肪肝中降低了约8倍(如表1)。NADPH-合成酶,异柠檬酸脱氢酶和6磷酸葡萄糖脱氢酶活性在脂肪蓄积的早期阶段被抑制,但在脂肪过量蓄积的后期,这些酶的活性显著上升。肝脏脂肪沉积程度对葡萄糖6磷酸脱氢酶活性无影响(P > 0.05)(如表2)。随着肝脏脂肪沉积量的上升,氧化酶,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT),以及脂肪过氧化产物,丙二醛(MDA),显著上升(P<0.05)(如表3)。庸鲽、鳕鱼和黑线鳕是加拿大东海岸重要的海水养殖品种,然而,相关的必需脂肪酸和组织脂肪组成的资料确十分有限。大多数的海水鱼类不能体内合成多不饱和脂肪酸,因此,这些脂肪酸必须由饵料提供。本研究表明饵料中的脂肪主要被利用以及储存在鱼体肝脏,肌肉和其他组织中。本实验是为了研究庸鲽、鳕鱼和黑线鳕肌肉和肝脏中脂肪和脂肪酸组成,以为今后研究必需脂肪酸需求和使用其它脂肪源替代鱼油进行前期准备。实验中庸鲽平均体重为3704±22克,黑线鳕平均体重为538±83克,鳕鱼平均体重为276±61克,取样前均使用以鱼粉和鱼油为基础的商业饲料饲喂12周,鳕科鱼(鳕鱼和黑线鳕)和庸鲽饲料脂肪含量分别为14.7%和17.6%。肌肉和肝脏脂肪酸组成在甲酯化后采用气相色谱仪进行分析。脂肪使用Waters silica Sep-Pak?分离成为中性脂肪和极性脂肪,并采用Iatroscan测定脂肪组成,磷脂部分采用HPTLC的方法进一步分离成为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇,并进行脂肪酸的测定。其中饲料的分析测定采用AOAC (1990)的方法。饲料粗蛋白的(%N×6.25)使用Dumas法(Ebling 1968)在Leco蛋白自动测定仪上检测(Model FP-228, Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA)。能量的测定使用adiabatic bomb calorimeter检测(model 1261, Parr Instrument Company, Moline, IL, USA)。饲料脂肪和鱼肌肉脂肪提取采用Bligh & Dyer (1959)的方法.鱼肝脏脂肪提取采用Folch (1957)的方法。脂肪酸的制备采用Ackman (1998)的方法;中性和极性脂肪的分离采用Juaneda and Rocquelin (1985)的方法。磷脂组成的测定采用Vitiello (1978)和Olsen (1989)high-performance thin layer chromatography (HPTLC)的方法;脂肪组成(lipid class)的测定采用Parrish (1987, 1999)的方法。数据统计使用SPSS 10.0的Duncan’s多重比较, P<0.05为差异显著。鳕鱼和黑线鳕为瘦型鱼(lean fish),肌肉中脂肪含量低于1%,分别为0.8%和0.7%,庸鲽为中等肥型鱼(medium fat fish),肌肉中脂肪含量为8.0%。虽同属于鳕科,鳕鱼和黑线鳕肝脏脂肪含量差异显著,黑线鳕肝脏脂肪含量和肝指数分别为67.2%和7.0%,鳕鱼肝脏脂肪含量和肝指数为36.9%和2.4%。庸鲽肝脏脂肪含量和肝指数分别为30.7%和2.0%。三种实验鱼肝脏脂肪都以中性脂肪为主,分别为鳕鱼33.5%、黑线鳕65.2%、庸鲽27.1%;鳕鱼和黑线鳕肌肉脂肪以极性脂肪占多数,分别为0.64%和0.61%,占总脂肪量的83.6%和87.5%,庸鲽肌肉脂肪以中性脂肪为主,为6.9%,占总脂肪量的84.1%。鱼类肌肉总脂(total lipid)以高不饱和脂肪酸为主(PUFA),含量从40.8%到58.7%,鱼类肝脏总脂以单不饱和脂肪酸为主(MUFA),含量从41.3%到45.6%。三种实验鱼肌肉中饱和脂肪酸(SFA)含量无显著差异(P>0.05),庸鲽肌肉中MUFA含量显著高于鳕鱼和黑线鳕肌肉中MUFA含量(P<0.05),分别为(34.1%、15.3%、19.3%)。16: 1n-7,18: 1n-9和18: 1n-7是鳕鱼和黑线鳕肌肉中主要的MUFA,在庸鲽肌肉中,20:1n-9和22:1n-11与16: 1n-7,18: 1n-9和18: 1n-7同为MUFA的主要组成。庸鲽肌肉中PUFA的含量显著低于鳕鱼和黑线鳕肌肉中PUFA含量(P<0.05),分别为40.8%、58.7%和53.4%。相比鳕科鱼,庸鲽肌肉中含有较少的18: 2n-6, 20: 4n-6, 20: 5n-3, 22: 6n-3,庸鲽肌肉总脂DHA/EPA比例显著低于鳕鱼和黑线鳕(P<0.05),分别为1.2、2.2和2.3。庸鲽肝脏总脂肪中SFA和PUFA含量最高,在黑线鳕肝脏总脂肪中最低。黑线鳕肝脏中MUFA含量最高。DHA/EPA值在庸鲽肝脏总脂中的比例为1.4,在鳕鱼肝脏中最低,为0.8。实验鱼中性脂肪和极性脂肪的脂肪酸分析结果显示,中性脂肪中MUFA含量显著高于极性脂肪中的MUFA含量,而中性脂肪的PUFA含量却显著低于极性脂肪的PUFA含量(P<0.05)。鳕鱼和黑线鳕肌肉中性脂肪以PUFA为主,分别为52%和43.2%,18: 2n-6, 20: 4n-6, 20: 5n-3, 22: 6n-3含量在鳕鱼和黑线鳕肌肉中性脂肪中含量显著高于在庸鲽肌肉中性脂肪含量(P<0.05).庸鲽肌肉中性脂肪中MUFA是主要脂肪酸组成(40.6%)。16: 1n-7, 18: 1n-9, 20: 1n-9, 22: 1n-11含量为主要的庸鲽中性脂肪的脂肪酸组成。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine PC)是所有饲料脂肪和鱼类组织中磷脂的主要组成部分。在鳕鱼肝脏和庸鲽肌肉的磷脂中,还可以分离出phosphatidylethanoamine (PE)和phosphatidylinositol (PI)。庸鲽肌肉磷脂中,能分离出最多的磷脂种类,分别为PC,PI,PE和phosphatidic acid (PA)。不同种类鱼类和不同组织中分离提取的PC,PI,PE的脂肪酸组成保持相对稳定。其中PC中PUFA含量较高,而PE中PUFA含量最高,PI中含有大量的20: 4n-6。胆固醇含量测定显示,庸鲽肝脏中含有较高量的胆固醇,为7.4 (mg/g组织),鳕鱼和黑线鳕肝脏中胆固醇含量为2.2, 2.6 (mg/g组织)。而庸鲽肌肉中胆固醇含量低于鳕鱼和黑线鳕肌肉中胆固醇含量,但没有统计学上的差异(P > 0.05)。通过Iatroscan的分析检测,鳕鱼和黑线鳕肌肉中中性脂肪中胆固醇的含量分别为60.6%和51.7%。而庸鲽肌肉中性脂肪中只能分离检测都微量的胆固醇。本实验中,三油甘脂和磷脂分别是鱼类肌肉肝脏中性脂肪和鱼类所有组织极性脂肪的的主要组成部分。结论1鳕鱼和黑线鳕将大部分的脂肪储存在肝脏中,而庸鲽肝脏和肌肉同为脂肪储存器官。鳕科鱼肌肉没有储存能量的作用。2黑线鳕和庸鲽肝脏具有体内将EPA转化为DHA的能力,或者在肝脏中优先选择利用EPA,而储存DHA的能力。然而鳕鱼肝脏没有显示有这种能力。3鳕鱼和黑线鳕肌肉中胆固醇含量高于庸鲽肌肉胆固醇含量。4本实验中鱼类肝脏中性脂肪的脂肪酸组成反映了饲料脂肪酸组成。5无论是从鳕鱼或庸鲽,也不论是从它们的肌肉或肝脏中分离得到的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇,它们都显示了近似的脂肪酸组成。