背景与目的大肠癌（colorectal cancer,CRC）是临床最常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内,大肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第3位,其中在西方发达国家,大肠癌的发病率处于第2位。在我国,随着生活水平的不断提高以及高蛋白、高脂肪、低纤维素等饮食结构的改变,大肠癌的发病率呈上升态势,排在恶性肿瘤和致死因素的第4位,对人民健康和生命构成严重威胁。目前大肠癌发生的分子机制尚不十分清楚,其病因和危险因素复杂,一般认为其发生是机体的内因与环境的外因相互作用的结果。流行病学研究认为大肠癌的发生主要与饮食、遗传、环境等因素关系密切。目前研究证实大肠癌的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的过程,涉及到多条信号转导途径的异常激活、失活及多种癌基因、抑癌基因的异常表达。转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）及其受体与下游信号蛋白Smads组成了一个非常复杂的信号传导网络,其信号转导需要TGF-β受体和Smads的参与,此信号通路的异常是肿瘤的发生发展以及浸润和转移的重要因素。Smad4是Smads家族成员之一,是转导TGF-β信号的重要胞浆内信号级联分子,是TGF-β信号通路上的重要调节靶点,在传导信号由细胞膜到细胞核内调节靶基因的转录过程中起重要作用,其失功能,不管是表达缺失还是基因突变均与大肠肿瘤增强的侵袭和转移能力有关,它能够与活化的受体激活型Smads分子形成复合物,移位到细胞核与其他转录因子协同作用,调节TGF-β应答基因的转录。Wnt/β-catenin信号传导通路是一条在生物进化中极为保守的通路,这条包括Wnt族基因及其产物与β-连环素（β-catenin）基因等许多其他相关基因的蛋白质产物构成的极为复杂的信号通路控制了从果蝇到人类胚胎发育、细胞命运及组织器官形态形成以及肿瘤发生的诸多重大事件,它与细胞的发育分化密切相关,对正常和肿瘤细胞生长都至关重要。Wnt/β-catenin信号转导通路的失控在大肠肿瘤发生发展过程中具有重要作用,在约80%的结直肠肿瘤细胞中发现存在β-catenin的高转录活性,β-catenin蛋白在细胞核内异常聚集,与T细胞因子/淋巴增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor,Tcf/Lef）结合形成复合物激活Wnt下游靶基因的转录,如细胞周期素D1（cyclinD1）、紧密连接蛋白-1（Claudin-1）、c-myc等,导致细胞增殖失控而致癌。TGF-β/Smad4、Wnt/β-catenin信号通路异常与大肠肿瘤的发生、发展及转移密切相关,两条通路在结肠上皮细胞分化的调节过程中都起着重要作用。目前关于两条通路之间交互通话并且共同作用于大肠癌发生机制的研究很多,如Smad4基因可以与β-catenin/Tcf复合物在某些共同靶基因的调节过程中相互作用、聚合,又如有研究证实大鼠胃泌素启动子可被β-catenin/Tcf、TGF-β/Smads信号通路共同调节,这些都证明TGF-β信号介导者Smads家族成员可能参与了Wnt/β-catenin信号发放的调节,TGF-β途径可能与Wnt途径协同的调节某些基因的表达,但具体相互作用机制尚不明确。Smad4是否存在不依赖于TGF-β信号通路而通过作用于Wnt/β-catenin通路发挥其肿瘤抑制作用呢?已有研究初步支持这一论点。例如,有研究报道把Smad4导入Smad4缺失的SW480细胞可以导致这些细胞在裸鼠体内致瘤性的缺失,并伴随有E-钙黏蛋白（E-cadherin）和P-钙黏蛋白（P-cadherin）的诱导转录,E-cadherin可以抑制β-catenin介导的信号转导,提示Smad4可能通过E-cadherin对β-catenin的调节间接地影响Wnt通路的进程,亦有研究显示在大肠癌细胞中Smad4能够以一种不依赖于TGF-β信号通路的方式通过对肿瘤转移促进基因Claudin-1的调节来发挥其侵袭抑制功能,这些研究结果都提示Smad4可能参与调控了Wnt/β-catenin信号通路的传导过程。因此,本课题我们以Smad4是否参与调控Wnt/β-catenin信号通路的转导过程及探究其机制为线索进行研究。研究的目的在于阐明除了经典的TGF-β信号通路,Smad4还能否通过其它的信号通路对细胞增殖发挥负调控作用。在研究的第一部分我们构建Smad4真核表达载体并稳定转染Smad4基因缺失的大肠癌SW480细胞使之成功表达,第二部分中首先应用Topflash/Fopflash荧光素酶报告基因方法检测Smad4转染大肠癌细胞前后Wnt/β-catenin信号通路的活性,再分别以RT-PCR、Western Blot方法检测转染前后Wnt通路关键基因的mRNA及蛋白表达变化以探索Smad4对Wnt/β-catenin调节的机制,并重点观察Smad4是否影响Wnt通路关键分子β-catenin的细胞内转位情况。本研究初步阐明Smad4能以一种不依赖于TGF-β信号途径的方式发挥其肿瘤生长抑制作用,研究结果将为未来大肠癌的分子靶向治疗提供理论基础和新的思路。材料与方法1.构建Smad4真核表达载体从人宫颈癌HeLa细胞中克隆Smad4基因,以pcDNA3.1（+）为载体构建真核表达质粒。按照Genbank上公布的Smad4 mRNA序列（NM_<sub>005359）,在其编码区（CDS）两端设计分别带有BamHI、EcoRI酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应扩增Smad4 CDS区,BamHI、EcoRI双酶切回收PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1（+）,T4连接酶连接pcDNA3.1（+）与目的DNA片段,转化到感受态Top10菌液中,挑取单个阳性克隆菌落扩大培养,SDS碱裂解法制备重组质粒DNA后行BamHI、EcoRI双酶切鉴定,选择插入片段正确的克隆测序鉴定。2.Smad4转染大肠癌SW480细胞系及建立稳定细胞克隆用Lipofectamine 2000脂质体介导重组质粒转染大肠癌SW480细胞,以转染pcDNA3.1（+）空载体及未转染细胞作为对照。转染后24h用筛选剂量1000μg/mlG418进行抗性筛选,分离收集稳定克隆株细胞扩大培养,维持选择压力。转染Smad4重组质粒的命名为Smad4-SW480细胞、转染pcDNA3.1（+）空载体的命名为pc-SW480细胞,RT-PCR、免疫荧光检测转染前后Smad4基因表达及分布。3.Topflash/Fopflash瞬时转染检测Smad4对Wnt/β-catenin信号活性的影响Lipofectamine 2000脂质体介导双荧光素酶报告质粒瞬时转染SW480、Smad4-SW480及pc-SW480细胞,每组细胞分别转染Topflash或Fopflash,并以pRL-SV40作为内对照。48h后用Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit在GloMax Luminometry System下检测各组细胞荧光值,每组细胞Topflash/Fopflash的比值即代表该细胞Wnt/β-catenin信号活性,实验重复3次,每次每组细胞设3个复孔。4.RT-PCR检测Smad4对Wnt通路关键基因mRNA表达的影响Smad4转染对大肠癌SW480细胞中Wnt/β-catenin信号通路上关键基因β-catenin、Claudin-1、MMP-7 mRNA表达的影响用RT-PCR方法检测。5.Western Blot检测Smad4对Wnt通路相关蛋白表达的影响Smad4对Wnt/β-catenin信号通路上重要因子β-catenin（胞浆、胞核）、Claudin-1蛋白表达的影响用Western Blot检测,另外检测上皮细胞钙黏蛋白E-cadherin的表达变化。6.免疫荧光观察Smad4对Wnt通路相关蛋白细胞内分布的影响荧光显微镜下分别观察β-catenin、E-cadherin、Claudin-1在转染前后不同组别细胞内的表达分布。7.统计学分析数据采用SPSS13.0版统计学软件进行处理。每一实验结果至少重复3次,计量资料以均数±标准差表示,多样本均数的比较采用单因素方差分析（one-wayanalysis of variance）,组间多重比较采用Bonferroni法,以P＜0.05视为差异有显著性意义。结果1.重组质粒pcDNA3.1（+）-Smad4的酶切鉴定及序列测定结果SDS碱裂解法制备重组质粒DNA后行BamHI、EcoRI双酶切鉴定,证实有大小正确的插入片段;以pcDNA3.1（+）-Smad4重组质粒为模板进行PCR鉴定在预计目的片段处有明显亮带;重组质粒经Invitrogen公司测序及通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线比对,重组克隆与目的基因序列同源性100%,证明重组成功。2.稳定表达Smad4基因的SW480细胞模型构建结果重组质粒转染Smad4基因缺失的大肠癌SW480细胞,通过G418抗性筛选得到细胞克隆Smad4-SW480及其对照pc-SW480细胞。RT-PCR结果证实通过基因转染得到了外源性Smad4高表达的SW480细胞,荧光显微镜观察下可见Smad4蛋白在SW480细胞中主要为细胞核和细胞浆表达,说明重组质粒在SW480中表达成功,转染pcDNA3.1（+）空质粒、未转染的SW480细胞均无可见荧光。以上结果证明Smad4基因高表达的结肠癌细胞模型构建成功。3.Smad4对Wnt/β-catenin信号转录活性的影响检测结果经单因素方差分析得出SW480细胞转染前后双荧光素酶报告基因活性有显著差异（P=0.000＜0.05）,采用Bonferroni法进行组间多重比较得出,稳定转染Smad4基因的Smad4-SW480（1）（2574.44±449.725）、Smad4-SW480（2）（2768.89±699.383）细胞荧光素酶活性相对值显著低于SW480细胞（8506.67±910.536）（P=0.000＜0.05）,提示Smad4表达重建显著降低了SW480细胞中Wnt/β-catenin信号转录活性,而SW480与转染空载体的pc-SW480细胞荧光素酶活性相比较差异无统计学意义（P=1.000＞0.05）。4.Smad4重建对β-catenin mRNA、蛋白表达及在细胞内分布的影响β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路上起着关键的调控作用,其表达水平及细胞内分布情况能直接反应Wnt通路的状态。RT-PCR结果用比较β-catenin与GADPH的比值得出,Western Blot（胞浆、胞核）结果用β-catenin与β-actin的比值得出。无论在mRNA还是蛋白水平,Smad4-SW480（1）、（2）细胞组β-catenin表达量与SW480细胞组相比差异均有显著统计学意义（P＜0.05）,提示Smad4重建降低了SW480细胞β-catenin的转录活性以及胞浆、胞核的蛋白表达水平,而SW480与转染空载体的pc-SW480细胞相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。因为β-catenin在Wnt通路信号传导过程中发挥作用与其在胞浆、胞核的分布密切相关,我们应用间接免疫荧光法进一步分析β-catenin在Smad4基因转染前后不同细胞内的分布情况。荧光显微镜观察下可见在无Smad4基因表达的SW480细胞中,β-catenin蛋白主要分布于胞浆,少量分布在胞核,转染Smad4基因后,β-catenin发生自胞浆、胞核向胞膜的转移。5.Smad4重建对E-cadherin、Claudin-1蛋白表达的影响E-cadherin已知能够与β-catenin结合成为复合体起着负性调节Wnt/β-catenin信号活性的作用。稳定表达Smad4的Smad4-SW480（1）、（2）细胞组E-cadherin蛋白表达水平与SW480细胞组比较差异有显著统计学意义（P=0.000＜0.05）,Smad4重建提高了SW480细胞E-cadherin蛋白表达水平,而SW480与pc-SW480细胞E-cadherin蛋白水平比较无显著差异（P=0.202＞0.05）。Claudin-1蛋白是一种已知的β-catenin信号下游重要的靶蛋白,对Claudin-1蛋白相对表达量进行多重比较得出Smad4-SW480（1）、（2）细胞组与SW480细胞组之间均有显著差异（P=0.000＜0.05）,提示Smad4表达降低了大肠癌SW480细胞Wnt通路下游Claudin-1蛋白水平,间接证明其对Wnt通路起着负性调节的作用。6.Smad4对Claudin-1、MMP-7 mRNA表达的作用Claudin-1、MMP-7是Wnt/β-catenin信号通路下游重要的代表分子。Smad4-SW480细胞Claudin-1 mRNA水平与SW480细胞相比差异有显著性意义（P=0.000＜0.05）,提示Smad4重建降低了SW480细胞中Claudin-1的mRNA表达。同法比较各组间MMP-7 mRNA表达,Smad4-SW480与SW480之间有显著差异（P=0.024＜0.05）,提示Smad4能够降低SW480细胞中MMP-7 mRNA表达,以上结果提示Smad4对Wnt通路下游基因转录起着负性调节的作用。结论1.运用基因重组技术构建得到pcDNA3.1（+）-Smad4真核表达质粒。2.重组质粒稳定转染Smad4基因缺失的大肠癌SW480细胞得到Smad4-SW480细胞克隆,经RT-PCR及免疫荧光技术证实得到外源性Smad4高表达的大肠癌SW480细胞系,表明成功构建了Smad4基因稳定表达的大肠癌细胞模型。3.通过瞬时转染双荧光素酶报告基因的方法测定Wnt/β-catenin信号,证实Smad4对大肠癌细胞系中Wnt/β-catenin通路的活性有抑制作用。4.Smad4重建能降低Wnt/β-catenin通路分子开关β-catenin mRNA及蛋白（胞浆、胞核）表达水平,并导致β-catenin发生自胞浆、胞核向胞膜的转位。5.Smad4在大肠癌细胞中能诱导上皮细胞钙黏蛋白E-cadherin表达增强,同时能降低紧密连接蛋白Claudin-1的蛋白表达水平。6.Smad4能抑制Wnt/β-catenin通路下游靶基因Claudin-1、MMP-7的mRNA表达。7.Smad4在大肠癌细胞中参与调控了Wnt/β-catenin信号通路的转导过程,对Wnt信号有负性调节作用。本研究提示Smad4除了参与经典的TGF-β信号通路外,还可能通过Wnt/β-catenin信号途径发挥肿瘤抑制作用。