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研究背景及目的Kruppel-like factor 14(KLF14)也称为BTEB5,属于Sp/KLF基因家族,是一种转录因子。新近发现细胞代谢相关基因KLF14可能在肿瘤发展过程中发挥重要作用,但是它在肝癌增殖和转移过程中发挥什么样的作用尚不清楚。目的:本研究首先通过临床组织样本,检测KLF14在肝癌中的表达情况,然后在肝癌细胞中通过过表达的方法,观察KLF14表达上调对肝癌细胞生长和迁移的作用。最后,探讨KLF14抑制肝癌转移的分子机制,为KLF14在肝癌治疗研究提供更多理论基础。方法:1.对含180例样本的组织芯片进行免疫组化,检测KLF14的定位和表达。2.借助KMplotter网站分析KLF14表达与生存期的关系,预测其预后价值。3.在Bel-7402和HepG2细胞瞬转KLF14过表达质粒或对照质粒,应用Real time PCR和western blot分别从mRNA和蛋白水平验证转染效果。4.采用crispr-cas9技术进行KLF14的敲除,通过测序、CruiserTM Enzyme酶切、western blot验证敲除效果。5.应用CCK8实验和克隆形成实验探索KLF14对肝癌细胞增殖的影响。裸鼠成瘤实验从体内进一步验证过表达KLF14对肝癌细胞增殖的作用。6.应用划痕实验和transwell实验探索KLF14对肝癌细胞迁移能力的影响。7.在Bel-7402和HepG2细胞瞬时转染KLF14过表达质粒或对照质粒,通过Real time PCR和western blot技术分别从mRNA和蛋白水平探索KLF14对EMT上皮标志物E-cadherin、间质标志物Snail、Vimentin、N-cadherin表达水平的影响。8.通过Jaspar网站寻找vimentin启动子上的KLF14结合位点,通过双荧光素酶实验探索KLF14对vimentin启动子活性的影响,通过CHIP实验探讨KLF14是否能结合到vimentin启动子。9.在Bel-7402细胞和HepG2细胞共转染KLF14过表达质粒和vimentin过表达质粒,通过回复实验探索KLF14是否通过vimentin发挥肿瘤抑制作用。结果:1.KLF14在肝癌中的表达KLF14在临床样本中的表达:对免疫组化的结果进行统计分析,发现相对于癌旁组织,肝癌组织中KLF14表达量较低;利用KMplotter网站分析KLF14表达与生存期的关系,发现KLF14高表达的患者总生存期高于KLF14低表达的患者。2.KLF14可抑制肝癌细胞的增殖、迁移能力KLF14对肝癌细胞功能的影响:CCK8实验和克隆形成实验表明KLF14抑制肝癌细胞的增殖;裸鼠皮下成瘤实验表明KLF14敲除组的成瘤能力强于对照组。划痕实验和transwell迁移实验表明,上调KLF14的表达能抑制肝癌细胞迁移。3.KLF14直接调控vimentin的表达KLF14调节EMT:Realtime PCR结果显示,过表达KLF14可以增强上皮标志物E-cadherin的表达,降低间质标志物vimentin、N-cadherin的表达,在RNA水平上不影响snail的表达。Western blot实验表明相比对照组,KLF14过表达组的上皮标志物E-cadherin上调,间质标志物vimentin、N-cadherin表达下调,在蛋白水平上snail的表达下调。4.KLF14可通过vimentin发挥作用双荧光素酶实验证实KLF14抑制vimentin启动子活性,CHIP实验证实KLF14能结合到vimentin启动子区域,回复实验证明KLF14 通过viemntin抑制肝癌细胞的迁移。结论:KLF14通过逆转EMT抑制肝癌细胞的迁移。