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目的:临床收集人羊膜(Humanamnioticmembrane,HAM),制备人脱细胞羊膜(Human decellularized amniotic membrane,dHAM)并通过甲基丙烯酸酐(Methacrylic anhydride,MA)接枝改性,构建具有光交联特性的dHAMMA(dHAM methacrylate);基于GelMA水凝胶,制备具有双组分网络状(Bicomponent polymer network,BCN)结构的光交联型dHAM复合水凝胶(GelMA-dHAMMA);考察GelMA-dHAMMA复合水凝胶表征,探讨GelMA-dHAMMA体外促进人成纤维细胞增殖和分化的能力、成血管能力以及体内促进口腔黏膜缺损修复的能力;阐明GelMA-dHAMMA复合水凝胶促进口腔黏膜缺损修复的机制。方法:以新鲜HAM为原料,通过乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠(NaOH)、氯化铵(NH4Cl)进行脱细胞处理,获得dHAM;将dHAM浸泡于4%(V/V)的MA溶液中(MA溶于PBS中),进行甲基丙烯酸酰胺化,制备光交联型dHAMMA,考察dHAM、dHAMMA表征。通过光交联技术,制备厚度为2mm的GelMA-dHAMMA双组分复合水凝胶支架(GelMA,dHAMMA质量比为2:1)。由于dHAM缺乏光交联所需基团,通过将dHAM研磨成粉状,包埋于GelMA中,物理复合制备GelMA/dHAM(GelMA,dHAM质量比为2:1)水凝胶作为对比研究,考察GelMA、GelMA/dHAM及 GelMA-dHAMMA 表征。以 GelMA、GelMA/dHAM 以及 GelMA-dHAMMA 三种材料为实验组,而以未加任何材料为空白对照组,体外细胞培养行CCK8检测和免疫荧光检测。以GelMA、GelMA/dHAM以及GelMA-dHAMMA三种材料为实验组,以微孔滤膜组为对照组,通过鸡胚尿囊膜模型(Chick chorioallantoic membrane,CAM)探讨GelMA-dHAMMA的血管生成能力。选取新西兰大白兔作为动物黏膜缺损模型,将植入材料分成四组,GelMA组、GelMA/dHAM组、GelMA-dHAMMA组及完全空白对照组,通过大体宏观观察、计算创面愈合率、HE染色观察、免疫组化及Masson检测,评估创面愈合能力并阐明愈合机制。结果:电镜扫描(Scanning electron microscopy,SEM)下 dHAM、dHAMMA 均呈纤维网络状多孔结构,孔径分别为6.1±1.77μm,8.54±2.3μm。通过接枝改性反应,dHAMMA孔径较dHAM增大。GelMA呈三维多孔结构,孔径分布均匀,孔道连通性好,孔径约为54.94±11.15 μm。GelMA/dHAM呈三维多孔结构,孔径接近圆形,壁薄,大小均匀,平均孔径约为10.16±2.77μm,dHAM粉末分布在孔壁及孔腔内。GelMA-dHAMMA亦呈三维多孔结构,孔隙近圆形,壁薄,大小分布均匀,GelMA与dHAMMA界面互穿、互相连续,平均孔径约为27.87±9.28μm,差异具有统计学意义(p<0.05)。傅里叶变换红外图谱检测(Fourier-transform infrared,FTIR)显示 HAM接枝改性后出现新的化学键(生成甲基丙烯酰胺基团的双键)的形成。GelMA/dHAM与GelMA的峰型比较,在GelMA/dHAM红外光谱中没有出现新基团的明显吸收峰。GelMA-dHAMMA与GelMA/dHAM 比较,仍可见丙烯酰胺的特征峰的振动,而主链结构并未发生明显变化。在24h,dHAM、dHAMMA、GelMA、GelMA/dHAM及GelMA-dHAMMA的膨胀率基本稳定,吸水达到饱和,在36h时dHAM、dHAMMA、GelMA、GelMA/dHAM及GelMA-dHAlMMA吸水后的质量分别膨胀为原始重量的(7.38±2.44)%、(7.19±2.3)%、(494.58±11.41)%、(440.54±16.95)%及(418.21±18.95)%,dHAM 与 dHAMMA 之间无明显差异(p>0.05),GelMA、GelMA/dHAM 及GelMA-dHAMMA之间差异有统计学意义(p<0.05)。随着时间延长(14d内),dHAM、dHAMMA的降解均持续存在,且降解明显,未到14d时,已基本降解完全,差异无统计学意义(p>0.05)。16d 内,GelMA、GelMA/dHAM 以及 GelMA-dHAMMA 的降解持续存在,但GelMA-dHAMMA的降解速率低于GelMA/dHAM和GelMA,差异具有统计学意义(p<0.05)。根据拉伸试验中dHAM、dHAMMA、GelMA、GelMA/dHAM以及GelMA-dHAMMA应力-应变曲线得知 GelMA-dHAMMA拉伸强度>GelMA>GelMA/dHAM>dHAM、dHAMMA,差异具有统计学意义(p<0.05),不过dHAM和dHAMMA之间拉伸强度无差异(p>0.05)。从体外细胞实验中我们发现GelMA-dHAMMA利于成纤维细胞增殖,差异具有统计学意义(p<0.05),其中GelMA-dHAMMA中α-SMA的表达荧光强度最明显。CAM模型血管生成实验中,GelMA/dHAM组和GelMA-dHAMMA组血管面积均大于对照组和GelMA组血管面积,组间差异有统计学意义(p<0.05)。其中,GelMA-dHAMMA组促血管优于GelMA/dHAM组,组间差异有统计学意义(p<0.05)。体内动物实验各时间点各组创口愈合率:GelMA-dHAMMA 组>GelMA/dHAM 组>GelMA 组>空白组,GelMA-dHAMMA组明显促进创面愈合,创面大多数接近完全愈合(p<0.05)。术后14d,CD34免疫组化检测,空白组未见明显新生血管内皮细胞,其余各组均可观察到新形成的毛细血管内皮细胞,其中GelMA-dHAMMA组毛细血管内皮细胞明显增加;术后14d,Masson染色检测,GelMA-dHAMMA组伤口组织所染蓝色深,创面胶原纤维排列整齐,优于GelMA/dHAM组和GelMA组,对照组伤口组织呈浅蓝色,胶原稀疏,排列无序。结论:通过MA可以对dHAM成功进行接枝改性,获得光交联特性dHAMMA。基于光敏性GelMA水凝胶,可以成功将光交联型dHAMMA通过光敏剂进行复合,构建具备双组分网络状结构的GelMA-dHAMMA复合水凝胶。GelMA-dHAMMA复合水凝胶既保留了 GelMA水凝胶良好的力学性能和保水性,同时继承了 dHAM的生物活性;避免了 GelMA水凝胶单独应用时生物活性成分不足的缺陷,同时也克服了dHAM单独应用时,力学不可控、易降解的限制。GelMA-dHAMMA复合水凝胶的力学性能明显强于dHAM,针对细胞生物学行为又明显优于GelMA水凝胶,且更能促进血管新生。GelMA-dHAMMA复合水凝胶本身就具有天然细胞外基质成分dHAM,能够更好的模拟ECM微环境,能够为缺损区成纤维细胞增殖和沉积提供稳定的环境,利于成纤维细胞的粘附、增殖、分化而显示出它的多功能性,细胞性能的提高进而促进口腔黏膜缺损的修复再生。因此GelMA-dHAMMA复合水凝胶支架材料可作为一种具有极大吸引力和广阔应用前景的口腔黏膜替代物来加速缺损修复愈合。