脂环酸芽孢杆菌,又称嗜酸耐热菌,是苹果汁及果蔬饮料加工中最常见的一种有害微生物,嗜酸耐热菌的检测技及控制已成为制约中国果汁产业发展的一个瓶颈。随着各国政府和消费者食品安全意识的增强,人们对安全、健康食品的要求越来越高,基于物理和微生物方法的食品危害因子控制技术已成为国际研究的热点。因此,本研究以乳酸菌为基本材料,首先筛选能够产生抗嗜酸耐热菌的细菌素产生菌,接着从细菌素产生菌的发酵上清液中分离纯化细菌素,并且对细菌素的作用机理、基因、结构、应用以及代谢合成等方面做了初步的探索性研究。主要研究内容和结果如下:(1)从20株实验室保藏的乳酸菌中筛选出三株具有抗嗜酸耐热菌活性菌株,分别为 L.paracasei CICC 20241,L.rhamnosu CICC 20975 和 B.animalis subsp.animalis CICC 6165。浊度法和琼脂扩散法筛选产细菌素的乳酸菌菌株的结果相符合,说明两种方法都可以用来筛选细菌素产生菌株。L.paracasei CICC 20241的含细菌素CFS热稳定性最强,能耐受100高温。除L.paracasei CICC 20241的含细菌素CFS在弱碱性下保持活性外,其余两株菌所产细菌素只在酸性条件下有活性。蛋白酶作用使得三种细菌素均失去活性,而脂肪酶和淀粉酶则对细菌素活性没有影响。同样果汁中常见的一些食品添加剂对细菌素活性也没有显著影响。细菌素合成曲线显示,三株乳酸菌的细菌素合成均为初级代谢过程。细菌素产量从乳酸菌菌体生长对数期前期开始,到稳定期前期达到最大。(2)试验检测不同的分离纯化方法对三株乳酸菌发酵上清液中细菌素的纯化效果,最终确定用硫酸铵沉淀串联SP-sepharose fast flow以及reverse-HPLC三步法分离菌株B.animalissubsp.animalis CICC 6165 所产的细菌素,命名为 bificin c6165;而采用产生菌细胞吸附解析法,加SP-sepharose fast flow和reverse-HPLC方法分离纯化菌株L.paracasei CICC 20241 和L.rhamnosu CICC 20975 所产细菌素,分别命名为 paracin C 和bacteriocinRC20975。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC图谱结果均显示,经过纯化后的细菌素可以达到色谱级纯度。三种细菌素的分子量分别约为:bificin C6165约3.4kDa,paracin C约为5.0 kDa,bacteriocin RC20975约为6.5 kDa。肽链N-端测序结果的数据库搜库结果显示,bificinC6165和paracinC为两种新发现的细菌素,而bacteriocinRC则与 Acidocin A 相似。(3)这三种细菌素无论对生长期还是稳定期嗜酸耐热菌细胞都具有很好的抗菌活性。不但对营养体细胞,细菌素对嗜酸耐热菌芽胞也有很好的杀灭效果。对三种细菌素作用机理的研究结果表明,三种细菌素都可以作用于嗜酸耐热菌细胞膜,致使胞膜通透性增加,细胞内容物泄露,从而导致死亡。电镜照片可清楚看到经细菌素处理后的嗜酸耐热菌胞膜结构破损。除了在细胞质膜上形成’孔洞结构’,bificinC6165还可与胞壁合成前体物lipid Ⅱ结合,阻止胞壁形成,从而导致细胞死亡。从检测到的嗜酸耐热菌细胞内容物泄露结果推测Paracin C作用于胞膜上的孔洞结构应大于0.5 nm,可允许大分子蛋白类物质的泄露。(4)根据N-端测序结果设计兼并引物,采用RACE-PCR法成功克隆bificinC6165的结构基因bifA。通过对核苷酸序列分析,发现bifA编码含有23个氨基酸残基的信号肽和包含33个氨基酸残基的成熟bificinC6165。由bifA预测的bificinC6165成熟肽的分子量比质谱测定的精确分子量多了 54 Da.质谱图谱揭示,是由于Ser,Thr被修饰后与cys的巯基发生亲核加成反应后,脱去一个H2O分子,形成环链结构造成的。对bificin C6165的等电点、疏水/亲水特性、螺旋结构、二硫键含量、跨膜区域、亚细胞定位等性质利用化学和生物信息学技术进行分析。实验测得bificin c6165等电点为8.9,略低于理论预测值9.0。可能是多肽结构对其结果的影响有关。GRAVY值为0.345说明,bificin C6165是一个具有疏水性结构的抗菌肽。在bificin C6165结构中,a-螺旋占主要部分,并且该细菌素在溶液中依然能保持一定的刚性结构。其二硫键含量为25.3 mol/106g。其次,对bificinC6165进行亚细胞定位分析,结果证明bificinC6165是一种分泌性蛋白。对其进行跨膜区域预测,没有发现跨膜区域的存在。推测可能存在于前体细菌素中,在分泌出细胞过程中被修饰加工系统切除(5)针对bificin C6165做更深入的研究。虽然相比在培养基中的抗菌活性有所下降,但bificin C6165在商业橙汁、苹果汁、葡萄汁、桃汁中都可以有效杀灭嗜酸耐热菌。遗憾的是在苹果汁中,bificin C6165失去了针对嗜酸耐热菌芽胞的活性。虽然bificin C6165在苹果汁中不能有效杀灭芽胞,但可以显著增加芽胞的热敏感性。细胞毒理实验证明bificin C6165对大鼠肝脏细胞没有细胞毒性。采用1.5%CaCl2,2%的海藻酸钠包裹bificin C6165,微囊形态和包封率都最优,包封率可达86%。胶囊在果汁中的作用效果表明用Ca-alginate包裹bificin C6165是一种便捷可行的方法。对加入bificin C6165和包裹胶囊后的果汁品质进行检测。Bificin C6165被CaCl-alginate包裹后对果汁品质没有影响。直接添加bificin C6165虽然会导致色值和透光度的下降,但仍在国家标准范围内。(6)对B.animalissubsp.animalis CICC 6165发酵生产bificin C6165的培养基类别组分和培养条件进行了优化试验。并对B.animalis subbsp.animalis CICC 6165的群体感应行为进行初探。最后研究了B.anima is subsp.Animalis CICC 6165产细菌素分批发酵代谢动力学动态过程。采用呈现典型的S型曲线的Logistic方程描述菌体生长符合其试验所得的生长曲线。因为细菌素的生成和菌体生长是偶联型的,所以也采用logistic方程来模拟产物合成的动力学过程;底物消耗的动力学过程规律采用Ledeking—Piret方程描述。实验结果显示,解释实验数据都能被建立的三个模型较好的解释。