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严重创伤失血(traumatic hemorrhage)是直接威胁患者生命安全的危急重症之一,常伴发全身系统性炎症反应,继而对机体重要脏器造成损害。肿瘤坏死因子是机体在受到创伤刺激后产生的一种内源性多效调节因子,与心血管疾患的进展紧密相关,且呈明显的双向效应。近年来,其在凋亡以及创伤修复过程中的调节作用日益引发关注。Notch信号通路对细胞的转归具有决定性作用,其参与维持机体组织结构和功能的稳定,以及损伤后的修复过程。但创伤失血后,其对心肌细胞能够产生何种影响,目前尚不知晓。实验目的：通过对创伤失血诱导大鼠心肌凋亡模型进行研究,探讨Notch1信号对心肌细胞的保护性转导途径,筛选能够保护心肌免于凋亡的相关药物,为深入了解创伤失血的损伤机理及治疗预防研究奠定一定的基础。实验方法：第一部分：创伤失血诱导大鼠心肌细胞凋亡及药物保护机制的初步评估1、构建急性创伤性失血大鼠模型,随机分为五组(n=10),实验组分别给予螺内酯、瑞舒伐他汀及厄贝沙坦干预,对照组及创伤组正常喂养。2, ELISA检测各组大鼠血清0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h时间点IL-2、IL-6、 IL-10及TNF-a水平变化;取心肌组织行HE染色;WB及rt-PCR检测心肌Bcl-2/Bax的表达、以及Akt/Notch1/Hes1通路的表达。第二部分：低浓度TNF-a激活Akt/Notch1/Hes1信号通路及其对心肌细胞凋亡的影响机制1、体外心肌细胞培养,构建创伤引发心肌凋亡模型；2、Tunel法检测细胞凋亡的发生;3、检测低浓度TNF-a对心肌细胞Bcl-2/Bax与caspase-3,9的表达的调控作用,以及siRNA敲低Notch1表达后的变化;4、检测低浓度TNF-a对心肌细胞Akt/Notch1/Hes1通路的影响,以及敲低Notch1表达后的变化;5、过表达Notch1信号,检测Bcl-2/Bax的变化。第三部分：瑞舒伐他汀、螺内酯及厄贝沙坦在创伤失血导致心肌凋亡过程中的保护作用及比较1、体外构建创伤刺激致心肌凋亡模型，检测caspase-3,9和Bcl-2/Bax的表达以及药物干预后的变化。2、瑞舒伐他汀、螺内酯和厄贝沙坦干预后,分别比较各组心肌细胞caspase-3,9、Bcl-2/Bax、和Akt/Notch1/Hes1信号通路的变化,以及siRNA敲低Notch1表达后的影响。结果：第一部分：创伤失血诱导大鼠心肌细胞凋亡及药物保护机制的初步评估1、创伤失血后1h时,大鼠血清中TNF-a达峰值;4h时IL-6及IL-10达最高值；8h时,IL-2含量最低;随时间延长,IL-2、IL-6、IL-10和TNF-a均逐渐恢复至基础水平;药物干预组TNF-a水平较创伤组显著升高,且持续时间延长(p<0.05)。2、HE染色：创伤组心肌组织可见形态改变、肿胀和巨噬细胞聚集;药物处理组心肌细胞体积缩小、周围炎症细胞减少。3、创伤组大鼠心肌Bax表达上调,Bcl-2表达下调,(p<0.05)：药物干预后,Bax表达降低,Bcl-2表达升高,(p<0.05)。4、药物干预后大鼠心肌细胞中Akt/Notch1/Hesl信号通路被激活,Notch1/NICD/Hesl表达增加(p<0.05)。第二部分：低浓度TNF-a激活Akt/Notch1/Hesl信号通路及其对心肌细胞凋亡的影响机制1、予创伤血清进行心肌培养,刺激心肌细胞产生凋亡；WB及rt-PCR检测提示caspase-3,9增加、Bax上调/Bcl-2下调(p<0.05)。2、给予低浓度TNF-a干预后,心肌凋亡减轻;caspase-3,9减少、Bax下调/Bcl-2上调(p<0.05)。3、予siRNA敲低Notch1表达后,凋亡再次加重;caspase-3,9表达增加、Bax活化/Bcl-2受到抑制(p<0.05)。4、WB及rt-PCR检测提示低浓度TNF-a能够激活Akt/Notch1/Hesl信号通路;分别给予TNF-a阻断剂及siRNA敲低Notch1表达干预后,Akt/Notch1/Hesl信号被抑制。5、转染质粒Notch 1信号过表达后,Bax下调／Bcl-2上调。第三部分：瑞舒伐他汀、螺内酯及厄贝沙坦在创伤失血导致心肌凋亡过程中的保护作用及比较1、Tunel实验发现,药物干预均能程度不同地减轻心肌凋亡。2、瑞舒伐他汀组：经WB及rt-PCR测定证实caspase-3,9表达下调,Bax抑制/Bcl-2激活,Akt/Notch1/Hes1活化(p<0.05)：敲低Notch1的表达后,呈现相反的表现(p<0.05)。3、螺内酯组：同瑞舒伐他汀组,但敲低Notch1后,caspase-9及Bcl-2的变化无统计差异。4、厄贝沙坦组：同瑞舒伐他汀组,但敲低Notch1的表达后,caspase-9、Bax/Bcl-2表达变化无统计差异。结论：1、创伤失血大鼠模型给予心肌保护药物干预后,血清TNF-a升高且与创伤组相比,能长时间地保持相对较高的低浓度状态。2、低浓度]NF-α能够激活Akt/Notch1/Hes1信号通路,通过Notch1通道内源性保护作用,使心肌细胞免于创伤导致的凋亡。3、螺内酯、瑞舒伐他汀及厄贝沙坦能够保护细胞免于创伤反应引发凋亡。瑞舒伐他汀通过上调TNF-α,激活Akt/Notch1/HeSl信号通路,调节Bcl-2/Bax比例以减少细胞凋亡,发挥保护心肌作用;螺内酯组亦可以上调TNF-α,激活Akt/Notch1/Hes1信号通路,调整Bax表达从而发挥保护心肌作用;而厄贝沙坦拮抗凋亡的机制,并非依赖于Notch1通道。