【摘 要】
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目的:在酵母细胞中异体表达人类抑癌蛋白p53并探讨利用酵母检测p53功能的可能性。方法:以乳腺癌细胞株MCF-7(含野生型p53)的RNA逆转录产物cDNA为模板,经PCR扩增野生型p53基因
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目的:在酵母细胞中异体表达人类抑癌蛋白p53并探讨利用酵母检测p53功能的可能性。方法:以乳腺癌细胞株MCF-7(含野生型p53)的RNA逆转录产物cDNA为模板,经PCR扩增野生型p53基因并克隆于受半乳糖诱导的酵母表达质粒pRS426Gal1/10中,使用定点突变构建突变型p53(R248W、G245S、R273H和R249S),经测序确认后质粒转化到酵母细胞,观察p53诱导表达后酵母细胞的凋亡和生长状况。利用蛋白印迹(Western blot)检测不同诱导时间p53的表达,应用原位末端标记法(TUNEL)检测DNA断裂、Annexin V-FITC/PI法检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻指示细胞凋亡。结果:野生型p53诱导3小时后酵母菌即出现生长抑制,诱导9小时后可检测到p53表达,并随时间延长表达增加,生长抑制更甚,酵母细胞出现典型的凋亡表型。而表达突变型p53(R248W、G245S、R273H和R249S)的酵母细胞则未观察到明显的凋亡和生长抑制。结论:酵母可异体表达人类抑癌蛋白p53,依据酵母细胞的生长状况可反映p53诱导细胞凋亡的功能。
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