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第一部分TIGIT分子调控健康个体NK细胞功能异质性的机制研究[目的]研究TIGIT分子在健康个体NK细胞上的表达及其调控NK细胞功能异质性的作用机制。[方法]收集健康志愿者和四个疾病组(非活动性HBV携带者、潜伏性结核感染、自身免疫病、胃肠癌)患者的新鲜外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood monocyte cells,PBMCs)。使用流式细胞仪检测NK细胞表面TIGIT分子的表达。流式评估NK细胞的表型和功能并分析其与TIGIT表达水平的相关性。在健康个体PBMCs中加入TIGIT Fc融合蛋白或对照IgG共同孵育,观察封闭TIGIT信号通路后对NK细胞分泌细胞因子的能力及杀伤活性的影响。[结果]我们发现TIGIT分子明显表达在NK细胞表面。健康个体NK细胞上TIGIT的表达水平呈现个体差异性,且和NK细胞的表型和功能呈负相关关系。根据TIGIT的表达水平可以将NK细胞分为三个亚群,低表达TIGIT(TIGIT%:30%-50%)、中表达 TIGIT(TIGIT%:50%-70%)和高表达 TIGIT(TIGIT%:70%-90%)的 NK 细胞。我们发现TIGIT低表达的NK细胞其脱颗粒、细胞因子分泌和杀伤活性均高于TIGIT高表达的NK细胞,但TIGIT表达水平与健康个体NK细胞的凋亡和增殖能力无明显相关性。封闭TIGIT信号通路后明显提高NK细胞分泌细胞因子的能力,特别是在TIGIT高表达的NK细胞中。和健康对照相比,我们进一步发现消化道肿瘤患者NK细胞上TIGIT的表达水平明显增高,相反,该分子在自身免疫病患者NK细胞上的表达水平显著降低。并且,消化道肿瘤和自身免疫病患者NK细胞上TIGIT的表达水平和分泌IFN-γ的能力也呈负相关关系。[结论]健康个体NK细胞上TIGIT分子的表达具有个体差异性,且TIGIT表达水平和NK细胞功能异质性相关。该研究发现并证实了 TIGIT信号通路是调控健康个体NK细胞功能异质性的分子机制,也在一定程度上解释了个体间对多种疾病,如感染、自身免疫病和肿瘤易感性的不同。第二部分探讨健康成人NK细胞功能的参考区间[目的]探讨NK细胞功能检测的方法并建立健康成人NK细胞功能的参考区间。[方法]该研究纳入160例健康成人和30例新近诊断的结直肠癌患者。采集其新鲜外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs。使用IL-12和IL-18诱导PBMCs,并通过流式胞内细胞因子染色技术检测NK细胞胞内IFN-y的表达。PBMCs与人白血病细胞K562共同孵育后,流式检测NK细胞表面脱颗粒指标CD107a的表达。使用IL-12活化PBMCs,收集细胞培养上清液,并使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清液中可溶性 IFN-γ 的水平。[结果]健康成人NK细胞分泌IFN-y的能力和CD107a的表达呈正相关关系,而且和IL-12诱导后PBMCs上清液中可溶性IFN-y的水平也呈正相关关系。因此,以上三个指标均可用于评估NK细胞的活性。此外,在评估年龄和性别对NK细胞活性的影响时,我们发现NK细胞活性在不同年龄、性别组的健康成人中无明显统计学差异。我们用评估了 160例健康个体NK细胞中IFN-γ和CD107a的表达以及PBMCs上清液中可溶性IFN-γ水平,建立了代表NK细胞功能指标的参考区间。以上指标的均值和参考区间分别为:IFN-y+NK(%):28.09(11.3-51.95);CD107a+NK(%):17.90(9.852-27.56);可溶性 IFN-y(pg/ml):330.4(41.38-717.8)。我们进一步在结直肠癌患者中对已建立的参考区间进行验证,发现癌症患者NK细胞中IFN-y的表达(11.28 ±0.8075 vs.28.09 ±1.014,p<0.001)和 CD107a 的表达(5.151±0.8526vs.17.9 ± 0.4198,p<0.001)确实显著低于健康成人水平。[结论]该研究使用较简便的方法来综合评估NK细胞功能,建立了健康成人NK细胞功能的参考区间,并在结直肠癌患者中进一步验证了该区间的潜在临床应用价值。NK细胞功能参考区间在宿主免疫状的评估,免疫相关性疾病的诊断和预后监测中具有重要的临床价值。第三部分采用多色流式技术建立健康成人全血淋巴细胞功能的参考区间[目的]建立使用流式评估全血中淋巴细胞活性的方法及健康成人淋巴细胞功能的参考区间。[方法]收集200例健康成人的新鲜外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs。在PMA/离子霉素的诱导下,通过流式胞内细胞因子染色技术检测CD4+T、CD8+T和NK细胞胞内细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)的表达。流式检测CD4+T、CD8+T细胞、NK细胞天然状态下活化性受体(HLA-DR、NKG2D)、趋化因子受体(CCR7)的表达及其杀伤活性。流式检测稀释全血在PMA/离子霉素诱导后,CD4+T、CD8+T细胞、NK细胞中IFN-γ的表达。[结果]PBMCs在PMA/离子霉素诱导下,CD4+T、CD8+T和NK细胞分泌IFN-γ的能力与TNF-α和IL-2均呈正相关关系,IFN-γ的分泌能力与细胞的活化、趋化及杀伤活性之间也存在显著的相关性。因此,可以将IFN-y的分泌能力作为评估淋巴细胞功能的指标。为了进一步简化实验步骤,我们使用稀释的全血代替PBMCs,通过探讨不同浓度PMA及不同作用时间的诱导条件下对IFN-γ分泌的影响,发现50 ng/ml PMA联合1μM离子霉素作用4小时是活化稀释全血的最适条件。因此,我们建立了在全血中通过流式检测IFN-y表达来同时评估CD4+T、CD8+T和NK细胞功能的方法,且该方法在检测同一个体的多个样本时具有很好的可重复性。据此,我们建立了健康成人CD4+T、CD8+T和NK细胞功能的参考区间,并进一步在肾移植术后和系统性红斑狼疮患者中进行了验证。结果发现,和健康成人相比,移植术后患者的淋巴细胞活性显著降低,而系统性红斑狼疮患者的淋巴细胞活性则显著升高。[结论]该研究用IFN-γ 一项指标同时对三种淋巴细胞功能进行评估,为临床评估淋巴细胞功能提供了更加简便、易行的实验方法。我们建立的健康成人CD4+T、CD8+T和NK细胞功能参考区间,在宿主免疫状态的评估、疾病诊断、预后监测和个体化治疗中具有重要临床意义。