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目的:Hedgehog(Hh)信号通路不仅是胚胎发育时期骨骼形成及发育的重要传导途径,还能双向调控出生后的骨组织,维持内环境的稳定性。Sonic Hedgehog(Shh)是Hh信号通路的最重要的配体之一,越来越多的证据表明,Shh通路在成骨过程中起着重要作用。融合蛋白抑制剂(Suppressor of fused protein,Sufu)是Shh信号通路的抑制蛋白,负调节Hh信号通路的转录因子Gli。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)是近期应用较多的一类干细胞,可用于细胞再生和干细胞治疗。miRNA-342-3p在人体多个组织中均有表达,在原发骨髓纤维变性其表达水平大幅下调,而在多发性骨髓瘤中高表达,迄今为止并未见骨相关细胞内miRNA-342-3p研究的报道。在本项目中,我们致力于探讨miRNA-342-3p是否通过Sufu/Gli信号轴,在Hh信号通路的成骨效应中发挥调控作用。方法:我们对诱导hUCMSCs成骨细胞分化过程中表达的miRNA进行高通量测序分析,检测其表达量的变化,并验证了对成骨细胞生成过程中高表达的miRNA。预测miRNA-342-3p可能作为关键因子通过Hh信号通路调控成骨过程。然后我们分别构建过表达miRNA-342-3p的慢病毒载体和抑制miRNA-342-3p的慢病毒载体,分别转导hUCMSCs。通过RT-PCR和蛋白水平检测观察过表达或沉默miRNA-342-3p时细胞内Hh信号通路及成骨相关因子的表达变化。继而应用荧光素酶报告基因活性检测,分析miRNA-342-3p对Sufu有无靶作用。同时在过表达Sufu转染的hUCMSCs中加入miRNA-342-3p过表达或抑制表达病毒,观察Hh信号通路及成骨相关因子的表达变化及细胞成骨分化程度,以此进一步分析miRNA-342-3p对Sufu的靶作用。最后我们将过表达miRNA-342-3p或Sufu的重组病毒转导hUCMSCs后复合骨移植材料β-TCP,植入大鼠颅骨骨缺损处,体内观察miRNA-342-3p是否通过Sufu调控Hh信号通路从而促进骨再生。结果:通过miRNA高通量测序和RT-PCR验证,预测miRNA-342-3p可能作为关键因子(P<0.02)通过Hh信号通路调控成骨过程。软件预测miRNA-342-3p可能靶向Sufu,通过调节Hh信号通路来调节成骨。然后构建过表达和抑制表达miRNA-342-3p慢病毒转染hUCMSCs,验证了miRNA-342-3p可以激活Hh信号通路,其中Smo(P<0.01),Gli1(P<0.01),Gli2(P<0.01),Gli3(P<0.05),同时也促进成骨相关因子的表达,ALP(P<0.01),Cbfa1(P<0.05),OPG(P<0.01),TGF-β(P<0.01)。继而进一步构建了Sufu过表达质粒,双荧光素酶检测实验验证miRNA-342-3p和Sufu的靶向关系(P<0.01)。RT-qPCR和蛋白水平检测进一步验证了两者的相反的作用趋势(P<0.01)。我们的结果中还有个有趣的现象,TGF-β在成骨过程中表达水平也有显著变化(P<0.01),可能证明Hh信号通路与TGF-β信号通路共同调节成骨过程。最后在体内实验中,填充过表达miRNA-342-3p细胞材料复合物实验组骨组织显著增生(BV/TV,P<0.01),进一步验证了我们的体外实验结果。结论:本研究的结果将有助于进一步探讨Hh信号通路在骨改建中的作用机制,并筛选出并验证了新的调控因子miRNA-342-3p作为靶分子对骨改建过程进行精准调控,为种植义齿骨组织工程提供新的治疗思路。