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【目的】自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）是机体中固有免疫系统的关键效应细胞,在机体抑制微生物感染方面起着重要作用,是阻止肿瘤发生和发展的第一道防线。NKG2D Ligands（NKG2DLs）是NK细胞识别和杀伤肿瘤的关键配体。健康细胞表面表达NKG2DLs相对较低,当细胞发生恶性转化,其在肿瘤细胞表面表达上调。NK细胞就能通过NKG2D与配体结合并杀伤肿瘤细胞。然而,肿瘤晚期,肿瘤细胞及其微环境中的去整合素和金属蛋白酶蛋白质（a disintegrin and metalloproteinase,ADAM）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases,MMP）、组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase,HDAC）等多种蛋白酶协同作用,通过水解使肿瘤细胞表面多种NKG2DLs脱落,进而发挥免疫逃逸的机制。虽然调控癌细胞表面NKG2DLs表达分子机制已经有了较为深刻的认识,但目前不同蛋白酶在肝癌细胞中影响NKG2DLs脱落中的作用还不是很清楚。鉴于NKG2DLs脱落和可溶性NKG2DLs能促进肝癌的免疫逃逸,肝癌中NKG2DLs脱落的调节机制成为一个重要问题。本研究观察多种蛋白酶抑制剂是否能上调肝癌细胞株PLC/PRF/5、Hep G2、Hep3B中8种NKG2DLs（MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP 3、ULBP 4、ULBP 5、ULBP 6）表达,及增强NK细胞对肝癌细胞株的杀伤作用。通过蛋白酶抑制剂诱导肝癌细胞表面NKG2DLs表达上调,利用NKG2D依赖的方式清除肝癌细胞,为肝癌的免疫治疗提供新的方向,为今后的临床试验设计和联合治疗策略提供证据。【方法】1、检测三种肝癌细胞株（PLC/PRF/5、Hep G2、Hep3B）中8种NKG2DLs在基因水平和蛋白水平的表达情况,检测NK细胞对不同肝癌细胞株的杀伤敏感性,分析NKG2DLs的表达和杀伤敏感性之间的关系;2、将5种不同的蛋白酶抑制剂（Marimastat、CUDC-101、GI254023X、TAPI-1、Valproic acid）分别与Hep G2共同孵育24小时后,运用CCK-8法检测蛋白酶抑制剂对Hep G2细胞活性的影响,并在低浓度剂量作用下,通过流式细胞术检测Hep G2上NKG2DLs表达的改变,从而筛选出明显上调NKG2DLs表达的蛋白酶抑制剂CUDC-101;3、将不同浓度的蛋白酶抑制剂CUDC-101分别与3种肝癌细胞株共同孵育24小时后,检测肝癌细胞株表面NKG2DLs表达变化;4、检测CUDC-101处理前后,NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用的变化。【结果】1、不同肝癌细胞系中8种NKG2DLs表达表现为不同程度的上调。其中Hep3B细胞中只有少数的NKG2DLs有小幅度的表达上调,对NK细胞介导的细胞毒性敏感性最差。然而对NK细胞介导的细胞毒性更具敏感性的PLC/PRF/5肝癌细胞株表现为ULBP1、ULBP4、ULBP6、MICA和MICB的普遍上调;2、广谱MMP抑制剂Marimastat作用后,Hep G2细胞8种NKG2DLs表达没有明显变化。TAPI-1和GI254023X作用后,Hep G2细胞除了MICA、MICB表达有轻度上调,其余4种NKG2DLs上调不明显。此外,HDAC抑制剂能引起NKG2DLs表达上调。值得注意的是,除了ULBP3,CUDC-101能够明显上调其余7种NKG2DLs的表达;3、随着CUDC-101浓度的上调,三种肝癌细胞表面NKG2DLs表达都出现不同程度的上调;4、CUDC-101处理后,肝癌细胞对NK细胞介导杀伤作用的敏感性增强。【结论】1、8种NKG2DLs中,ULBP1、MICA、MICB可能影响NK细胞对肝癌细胞系的杀伤;2、肝癌细胞系NKG2DLs的表达不受MMP的影响。此外,CUDC-101能够明显上调Hep G2细胞中NKG2DLs;3、CUDC-101作用后,肝癌细胞株能够以剂量依赖性的方式上调肿瘤细胞表面多种NKG2DLs的表达;4、CUDC-101处理后,上调NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用。