肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种影响大脑和脊髓的运动神经元的进行性神经退行性疾病。ALS运动神经元的进行性退化最终会导致其死亡,当运动神经元死亡时,大脑启动和控制肌肉运动的能力逐渐受到影响,人们可能会失去说话、进食、移动和呼吸的能力,最终死于呼吸衰竭。ALS有两种不同类型,散发性和家族性。散发性ALS是最常见的,占所有病例的90%到95%。家族性ALS占所有病例的5%至10%。在患有ALS病例的家庭中,每一个后代都有50%的机会遗传基因突变并可能患上这种疾病。目前检测到一百多个基因突变与家族性ALS相关,这些基因突变增加了患者对ALS的易感性,改变了其临床进展。近些年来,神经胶质细胞功能紊乱引起的非细胞自主性作用引起了人们的研究关注。有研究表明,星型胶质细胞在包括ALS在内的神经退行性疾病中起着重要的作用。星形胶质细胞是一种复杂的、高度分化的细胞,分布整个中枢神经系统（central nervous system,CNS）,对健康CNS的正常功能具有重要作用,包括调节血流,向神经元提供能量代谢物,参与突触功能和可塑性,维持细胞外离子平衡、体液平衡和递质。此外,星形胶质细胞可以对各种形式的中枢神经系统损伤（如感染、创伤、缺血和神经退行性疾病）作出反应,例如分子表达和形态的改变,严重时还涉及瘢痕形成。神经炎症的发生是脑组织在紧急状态下维持稳态的反应之一,主要是由星形胶质细胞和小胶质细胞活化引发的。发生神经炎症反应时,CNS促炎因子表达水平增加（如细胞因子、炎症趋化因子、第二信使等）。研究表明,炎性细胞因子可以诱导神经元的神经退行性变,而自噬在炎症反应中扮演重要角色。自噬在机体中发挥着维持内环境稳态的作用。由于炎症反应能够扰乱细胞内环境的稳定,因此自噬可能有助于抑制炎症反应。一方面,自噬可以清除引起炎症反应的因素,如受损的线粒体;另一方面也可以通过抑制炎性复合物来保护细胞。而炎性细胞因子也可以通过影响胞质膜上附着的特殊受体调节细胞自噬。自噬在炎症反应中起怎样的作用,目前尚无定论。所以我们假设,自噬受损可能是ALS发病机制的重要因素之一,而自噬受损导致的星形胶质细胞炎性因子的分泌增多可能是ALS中星型胶质细胞对运动神经元非细胞自主性作用的重要原因之一。第一部分体外重编程患者体细胞获得ALS星形胶质细胞目的:运用分别携带四种转录因子的仙台病毒作为载体将三例ALS患者和三名健康对照者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）,并采用PCR技术、核型分析、STR检测、免疫荧光技术和流式细胞术进行细胞的质量检测,多能性分析和分化能力的鉴定。将ALS特异性的iPSC向神经干细胞（Neural Stem Cell,NSC）诱导分化,然后对所得到的NSC向成熟星形胶质细胞的分化,建立一套稳定获得高纯度的成熟星形胶质细胞的方法。方法:1.通过对PBMC重编程获得ALS特异性iPSC实验使用三例ALS患者和三名健康对照的外周血。采用Ficoll离心法分离其中的PBMC。以仙台病毒作为载体,将四种重编程转录因子导入PBMC中,重编程为iPSC。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力使用PCR检测iPSC病毒基因组表达,对得到的iPSC进行核型分析,STR检测,免疫荧光技术和流式细胞术检测其多能性和三胚层分化能力。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的NSC实验使用来自三例ALS患者和三名健康对照的iPSC,采用NSC单层分化的技术方案,通过7天诱导分化,可获得高纯度的NSC。实验选用P3代的NSC,分为Control组和Patient组,采用免疫荧光技术,分别对Nestin、SOX2、PAX6神经干细胞标志物进行检测,荧光显微镜观察成像,计算荧光强度,分析Control组和Patient组的蛋白表达差异。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞实验使用之前分化的来自Control组和Patient组的NSC,在星形胶质细胞诱导培养基作用下培养21天左右,期间使用差速离心,差速贴壁和振荡法相结合的方案进行纯化。获得的星形胶质细胞在星形胶质细胞培养基条件下培养35天使之成熟。实验选用培养8周的星形胶质细胞,分为Control组和Patient组,使用免疫荧光技术,分别对GFAP和S100β成熟星形胶质细胞标志物进行检测,荧光显微镜观察成像,计算荧光强度,分析Control组和Patient组的蛋白表达差异。结果:1.通过对PBMC重编程获得ALS特异性iPSC采用Ficoll离心法提取PBMC。选取培养5天的PBMC作为重编程细胞,使用携带四个重编程因子的仙台病毒进行转染,转染后第20天左右,通过传代培养即可产生相应的iPSC细胞系。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力1)PCR结果显示重编程后的iPSC经传代后无病毒残留,确保重编程质量;2)核型分析结果显示细胞核型未发生改变;3)STR检测结果显示重编程的iPSC与源细胞PBMC具有相同的源性;4)免疫荧光染色和流式细胞术结果显示,iPSC多能性细胞标志物均呈阳性,且组间荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）;5)免疫荧光染色结果显示,iPSC分化的三胚层细胞特异性标志物均表现出阳性。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的神经干细胞使用NSC单层分化的技术方案,可以在7天内将iPSC分化成NSC。免疫荧光实验检测表明,健康对照者和ALS患者来源的这些细胞均表达神经干细胞特异性标志物,且两组NSC荧光强度差异无统计学意义（P>0.05）。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞NSC在星形胶质细胞诱导培养基作用下向星形胶质细胞分化,在作用21天左右时,细胞表现出星形胶质细胞的特征形态。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞同时表达星形胶质细胞的特异性标志物GFAP和S100β,且ALS患者来源的星形胶质细胞GFAP（48.46±6.39）和S100β（36.98±2.58）的荧光强度与健康对照的GFAP（70.60±6.35）和S100β（57.38±6.43）相比显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）结论:1.通过对PBMC重编程可以获得ALS特异性iPSC。2.重编程获得的iPSC具有与PBMC同源性、多能性和多向分化能力。3.iPSC神经诱导1周可分化成高纯度的NSC。4.NSC可在体外8周内诱导分化为高纯度的成熟星形胶质细胞。第二部分ALS星形胶质细胞通过炎性因子分泌对运动神经元的影响目的:通过星形胶质细胞条件培养基作为实验路径,检测ALS星形胶质细胞对运动神经元的影响作用,以及星形胶质细胞培养基中的炎性因子分泌水平,再通过外源性炎性因子的刺激来探索ALS星形胶质细胞对运动神经元的作用方式。方法:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元实验选用一名健康对照来源的iPSC,在运动神经元诱导培养基的作用下诱导分化12天后,获得运动神经元祖细胞（motor neuron precursor cells,MNP）,利用免疫荧光技术对MNP的特异性标志物OLIG2和PAX6进行检测;继续诱导分化16天获得运动神经元,利用免疫荧光技术检测Ch AT和TUJ的表达情况。2.ALS星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的影响作用实验分成四组,Normal medium组、Fresh medium组、Control ACM组和Patient ACM组。Normal medium组取用运动神经元诱导基础培养基置于3个空器皿中,在细胞培养箱中静置48h后收集培养基;Fresh medium组直接取用运动神经元诱导基础培养基;Control ACM组取用运动神经元诱导基础培养基置于3名健康对照来源的融合度达到90%的成熟星形胶质细胞中,培养48h后收集培养基;Patient ACM组取用运动神经元诱导基础培养基置于3例ALS患者来源的融合度达到90%的成熟星形胶质细胞中,培养48h后收集培养基。用以上培养基分别加入运动神经元中,MTT法检测以上星形胶质细胞条件培养基和相应阴性对照对运动神经元细胞活力的影响作用3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌水平的检测实验选用融合度90%的成熟星形胶质细胞,分为健康对照组（Control组）、ALS患者组（Patient组）。运动神经元基础培养基48h后,收取各组培养基,ELISA检测各组培养基中的IL1β、IL6和TNFα的含量。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα对运动神经元细胞活力的影响作用实验分成四组:Control ACM组、Patient ACM组、Fresh medium组和Cytokines medium组。Control ACM组、Patient ACM组、Fresh medium组的制备参考第二部分2.6.1。Cytokines medium组,参考上一部分的结果,分别将溶解好的IL1β、IL6和TNFα储存液添加到运动神经元诱导基础培养基中,使其终浓度分别为120 pg/ml、185 pg/ml、180 pg/ml。MTT法检测炎性因子和星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的作用。结果:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元iPSC在诱导分化12天后,获得MNP。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞表达MNP的特异性标志物。MNP继续诱导分化16天后,获得MN。免疫荧光染色显示,有97%以上的细胞表达运动神经元的特异性标志物。2.ALS星形胶质细胞条件培养基对运动神经元细胞活力的影响作用MTT结果显示:与Control ACM组（0.647±0.070）相比,Patient ACM组（0.493±0.032）可以显著降低运动神经元细胞活性。而Normal medium组（0.673±0.047）,Fresh medium组（0.677±0.050）和Control ACM组（0.647±0.070）之间差异无统计学意义（P>0.05）。3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌水平的改变IL1β的ELISA结果显示,与Control组（18.96±8.49）相比,Patient组（39.94±9.10）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;IL6的ELISA结果显示,与Control组（119.30±4.62）相比,Patient组（186.30±7.84）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）;TNFα的ELISA结果显示,与Control组（105.60±8.80）相比,Patient组（179.90±27.45）相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα对运动神经元细胞活力的影响作用MTT结果显示:与Control ACM组（0.630±0.044）相比,Patient ACM组（0.510±0.026）和Cytokines medium组（0.473±0.047）可以显著降低运动神经元细胞活性（P<0.05）。而Fresh medium组（0.737±0.050）和Control ACM组（0.630±0.044）之间,Cytokines medium组（0.473±0.047）和Patient ACM组（0.510±0.026）之间差异无统计学意义（P>0.05）结论:1.iPSC诱导4周可分化成高纯度的运动神经元。2.ALS星型胶质细胞条件培养基可以降低运动神经元的细胞活性。3.ALS星形胶质细胞炎性因子IL1β、IL6和TNFα分泌增加。4.炎性因子IL1β、IL6和TNFα可以降低运动神经元的细胞活性。第三部分ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路对炎性因子分泌的调节作用目的:以ALS星形胶质细胞和健康对照作为实验对象,运用免疫荧光、Western blot、透射电镜观察ALS星形胶质细胞自噬活性的改变。在经典的自噬激活剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA干预下,运用免疫荧光、Western blot检测自噬活性的改变以及m TOR通路蛋白的表达以及炎性因子分泌的改变。方法:1.ALS星形胶质细胞自噬活性的改变实验选用Control组和Patient组的成熟星型胶质细胞。1)融合度达到70%-80%后,提取细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定两组的p62和LC3蛋白的表达水平;2)进行免疫细胞荧光染色,荧光显微镜采集图像,自动计数p62阳性荧光点数;3)固定后,制作超薄切片,透射电镜观察照相,计数两组自噬小体的数量。2.星形胶质细胞通过m TOR通路影响自噬活性实验选用融合度70%-80%的成熟星形胶质细胞,分为健康对照组（Control组）、健康对照+雷帕霉素组（Control+Rapamycin组）、健康对照+3-甲基腺嘌呤组（Control+3-MA组）、ALS患者组（Patient组）、ALS患者+雷帕霉素组（Patient+Rapamycin组）和ALS患者+3-甲基腺嘌呤组（Patient+3-MA组）。1)ALS星形胶质细胞中m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平的检测:提取Control组和Patient组细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平;2)Rapamycin和3-MA对ALS星形胶质细胞m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平的影响:Control+Rapamycin组、Control+3-MA组、Patient+Rapamycin组、Patient+3-MA组,分别使用Rapamycin和3-MA预处理48h后,收取各组细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定m TOR/p-m TOR、ULK1/p-ULK1、Beclin1/p-Beclin1蛋白表达水平;3)Rapamycin和3-MA对ALS星形胶质细胞p62和LC3蛋白表达水平的影响:提取细胞蛋白进行Western blot检测,BD成像系统显影成像,以GAPDH的表达作为内参,测定两组的p62和LC3蛋白的表达水平;进行免疫细胞荧光染色,荧光显微镜采集图像,自动计数p62阳性荧光点数。3.ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调节炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌实验选用融合度90%的成熟星形胶质细胞,分为Control组,Control+Rapamycin组、Control+3-MA组、Patient组、Patient+Rapamycin组和Patient+3-MA组。Control+Rapamycin组、Control+3-MA组,Patient+Rapamycin组、Patient+3-MA组,分别使用Rapamycin和3-MA预处理48h后,收取各组培养基,ELISA检测各组培养基中的IL1β、IL6和TNFα的含量。结果:1.ALS星形胶质细胞自噬活性的改变免疫荧光检测p62表达结果显示,与Control组（28.94±7.61）相比,Patient组（53.89±5.41）的p62免疫荧光阳性信号点数增加,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示,与Control组（0.84±0.19）相比,Patient组（1.45±0.12）的p62蛋白条带光密度相对水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与Control组（4.63±0.48）相比,Patient组（0.33±0.02）的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白条带光密度相对水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）。透射电镜结果显示,与Control组（4.25±0.31）相比,Patient组（1.22±0.28）的细胞内平均自噬小体数量增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.ALS星形胶质细胞通过m TOR通路影响自噬活性m TOR的Western blot结果显示,与Control组（0.97±0.17）相比,Patient组（1.50±0.14）和Control+3-MA组（1.50±0.08）相对蛋白表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.46±0.04）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.50±0.14）相比,Patient+Rapamycin组（1.45±0.20）和Patient+3-MA组（1.50±2.28）差异无统计学意义（P>0.05）。p-m TOR的Western blot结果显示,与Control组（1.94±0.08）相比,Patient组（1.04±0.28）和Control+3-MA组（0.83±0.26）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.86±0.07）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.04±0.28）相比,Patient+Rapamycin组（2.07±0.55）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.52±0.26）差异无统计学意义（P>0.05）。ULK1的Western blot结果显示,与Control组（1.80±0.15）相比,Patient组（1.26±0.10）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（1.80±0.25）和Control+3-MA组（1.50±0.05）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.26±0.10）相比,Patient+Rapamycin组（1.97±0.13）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（1.27±0.25）差异无统计学意义（P>0.05）。p-ULK1的Western blot结果显示,Control组（1.34±0.28）、Control+Rapamycin组（1.58±0.16）、Control+3-MA组（1.83±0.10）、Patient组（1.61±0.44）、Patient+Rapamycin组（1.45±0.54）、Patient+3-MA组（1.22±0.18）,各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。Beclin1的Western blot结果显示,Control组（1.11±0.30）、Control+Rapamycin组（1.51±0.14）、Control+3-MA组（1.44±0.10）、Patient组（1.07±0.28）、Patient+Rapamycin组（1.43±0.12）、Patient+3-MA组（1.61±0.11）,各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。p-Beclin1的Western blot结果显示,与Control组（1.66±0.40）相比,Patient组（0.65±0.22）和Control+3-MA组（0.62±0.11）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）;Control+Rapamycin组（1.16±0.11）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（0.65±0.22）相比,Patient+Rapamycin组（1.37±0.14）相对表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.62±0.11）差异无统计学意义（P>0.05）。p62的Western blot结果显示,与Control组（0.84±7.61）相比,Patient组（1.45±0.12）和Control+3-MA组（1.44±0.18）的p62蛋白相对表达水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（0.74±0.19）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（1.45±0.12）相比,Patient+Rapamycin组（0.85±0.30）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（1.81±0.14）差异无统计学意义（P>0.05）。LC3的Western blot结果显示,与Control组（4.63±0.48）相比,Patient组（0.33±0.02）、Control+Rapamycin组（1.78±0.03）和Control+3-MA组（1.37±0.14）的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相对表达水平降低;而与Patient组（0.33±0.02）相比,Patient+Rapamycin组（1.59±0.09）相对表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（0.60±0.14）差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光检测p62表达结果显示,与Control组（28.94±7.61）相比,Patient组（53.89±5.41）和Control+3-MA组（51.22±8.26）的p62免疫荧光阳性信号点数增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（27.11±5.59）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（53.89±5.41）相比,Patient+Rapamycin组（32.50±4.17）相对表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（54.11±9.00）差异无统计学意义（P>0.05）。3.ALS星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调节炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌IL1β的ELISA结果显示,与Control组（22.37±10.06）相比,Patient组（58.15±6.91）和Control+3-MA组（53.89±11.65）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（17.91±13.34）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（58.15±6.91）相比,Patient+Rapamycin组（22.74±7.62）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（57.92±11.90）差异无统计学意义（P>0.05）。IL6的ELISA结果显示,与Control组（119.30±4.62）相比,Patient组（186.30±7.84）和Control+3-MA组（188.30±16.27）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（75.22±39.15）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（186.30±7.84）相比,Patient+Rapamycin组（111.20±27.71）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（194.60±22.77）差异无统计学意义（P>0.05）。TNFα的ELISA结果显示,与Control组（105.60±8.80）相比,Patient组（179.90±27.45）和Control+3-MA组（173.50±22.49）的相对分泌水平增加,差异有统计学意义（P<0.05）,Control+Rapamycin组（58.70±9.21）差异无统计学意义（P>0.05）;与Patient组（179.90±27.45）相比,Patient+Rapamycin组（111.60±41.60）相对分泌水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）,Patient+3-MA组（178.40±21.36）差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.ALS星形胶质细胞自噬活性降低。2.星形胶质细胞通过m TOR通路调节自噬活性。3.星形胶质细胞通过m TOR自噬通路调控炎性因子IL1β、IL6和TNFα的分泌。