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目的:NLRP3炎症小体激活可以诱导IL-1β、IL-18等炎症因子的释放,引起组织的损伤。目前已发现诸如侧索硬化症、克罗恩病、阿尔兹海默病、帕金森病、抑郁、中风甚至肿瘤中都有NLRP3炎症小体参与,因此找到对NLRP3炎症小体激活有调控作用的蛋白激酶对于上述疾病的治疗将会有重要的意义。本研究通过筛选非受体酪氨酸激酶中对NLRP3炎症小体激活有调节作用的成员,探索其调节机制,为靶向抑制NLRP3炎症小体激活和治疗NLRP3炎症小体参与的疾病提供新的思路。方法:用脂多糖（LPS）作为一级信号刺激细胞3小时后,尼日利亚菌素（Nigericin）或三磷酸腺苷（ATP）作二级刺激信号处理细胞30～45分钟,激活细胞内NLRP3炎症小体。（1）非受体酪氨酸激酶库特异性si RNA,转染C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,沉默对应的非受体酪氨酸激酶基因,转染72小时,ELISA检测NLRP3炎症小体激活后下游炎症因子释放水平。（2）LPS刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞2小时,分别用HCK、JAK3、BTK抑制剂处理细胞1小时,Nigericin处理细胞30分钟,ELISA/Western blot检测NLRP3炎症小体激活后下游炎症因子释放水平。（3）靶向HCK特异性si RNA,转染单核细胞细胞系THP1,转染72小时,Western blot检测NLRP3炎症小体下游炎症因子IL-1β的释放。（4）LPS刺激C57BL/6小鼠的原代小胶质细胞或THP1细胞2小时,实验组加入HCK抑制剂A419259/PBS组做阴性对照1小时,Nigericin或ATP处理细胞30分钟,Western blot检测NLRP3炎症小体下游细胞因子释放水平。（5）HEK293T细胞共转染质粒Myc-HCK/Flag-NLRP3、Myc-HCK/Flag-PYD、Myc-HCK/Flag-NBD（NACHT）、Myc-HCK/Flag-LRR 36小时,免疫共沉淀检测表达蛋白之间的相互作用。（6）HEK293T细胞共转染Myc-HCK/Flag-NLRP3、Myc-HCK/Flag-ASC质粒36小时,Phos-tagTMSDS-PAGE胶检测HCK对炎症小体组分NLRP3蛋白和ASC蛋白的磷酸化。（7）LPS刺激C57BL/6小鼠的原代小胶质细胞2小时,实验组加入HCK抑制剂A419259 1小时,Nigericin或ATP处理细胞30分钟,免疫细胞荧光实验检测ASC的寡聚。（8）LPS刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞2小时,实验组加入HCK抑制剂A419259 1小时,Nigericin或ATP处理细胞30分钟,ASC寡聚实验,Western blot检测ASC的寡聚。（9）C57BL/6小鼠线栓法大脑中动脉结扎（MCAO）模拟中风,造模前通过立体定位向小鼠侧脑室注射1μl PBS和HCK特异性抑制A419259（6μg/μl）,腹腔注射100μl PBS和HCK特异性抑制A419259（6μg/μl）分别作为PBS对照组和实验组,术后6小时和24小时处死小鼠,取小鼠脑组织做切片,2,3,5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl-,chloride,TTC）染色观察梗死面积;分别取两侧大脑皮层,相同部位切片分成两等份,Western Blot检测抑制剂的抑制效果和炎症小体组分NLPR3、ASC、Caspase1的表达,Trizol法提取RNA,反转录cDNA,qPCR检测细胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α变化。结果:（1）小鼠腹腔巨噬细胞内转染非受体酪氨酸激酶库31种si RNA,用LPS和Nigericin刺激后,发现转入HCK、FES、TEC、JAK3相关si RNA的细胞IL-1β的分泌量同对照组相比明显降低（P<0.05）。（2）小鼠腹腔巨噬细胞中分别用HCK、JAK3、BTK的抑制剂处理细胞,发现用HCK和BTK抑制剂的细胞IL-1β的分泌量与PBS组相比明显降低（P<0.05）。（3）THP1细胞中转入靶向HCK的si RNA,用LPS,Nigericin刺激后与mock组相比,敲低HCK显著降低了细胞IL-1β的分泌量（P<0.05）。（4）小鼠的原代小胶质细胞或THP1中应用A419259的实验组和PBS组相比,IL-1β的分泌水平明显降低。（5）免疫共沉淀实验显示HCK与NLRP3可以相互结合,进一步发现,HCK与NLRP3的NBD、LRR结构域同样可以结合,但并不与PYD结合,HCK的激酶缺陷突变体HCK K267E与NLRP3同样可以结合。（6）HEK293T细胞共转染Myc-HCK/Flag-NLRP3、Myc-HCK/Flag-ASC,HCK抑制剂A419259处理细胞后,Phos-tagTMSDS-PAGE未检测到NLRP3和ASC的磷酸化水平与对照组有明显不同。（7）免疫细胞荧光结果观察到,抑制剂处理的原代小胶质细胞与PBS组相比ASC聚集明显减少。（8）腹腔巨噬细胞ASC寡聚实验结果显示,抑制剂组与PBS组相比ASC单体、二聚体、多聚体均明显减少。（9）缺血再灌注模型脑片TTC染色显示,6小时和24小时时间点PBS组和A419259组梗死面积无明显差异;qPCR结果显示,PBS组梗死侧24小时时间点IL-1β的m RNA水平明显高于6小时时间点（P<0.05）,PBS组与A419259组相比,24小时时间点A419259组il-1β的m RNA水平明显低于PBS组（P<0.05）,其它检测未发现A419259组与PBS组之间存在统计学意义上的显著变化。结论:（1）HCK与NLRP3的NBD、LRR存在相互作用。HCK通过促进ASC的寡聚,激活NLRP3炎症小体,此过程不依赖HCK激酶活性磷酸化ASC。（2）HCK可能参与MCAO模型的炎症进程。