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研究背景:幽门螺杆菌(H.pylori)是一种常见的人类致病菌,一旦感染宿主,很难通过免疫系统被清除。研究表明,幽门螺杆菌能附着于上皮细胞,并能持续定植,先引发胃炎,进而参与胃癌的发生。虽然有多联抗生素治疗,但是耐药严重,难以有效清除。因此,深入研究幽门螺杆菌感染胃粘膜细胞后的定植情况和机体对幽门螺杆菌定植的调节机制,对于治疗幽门螺杆菌感染,进而遏制菌引发的炎症及胃粘膜进一步的恶性转化,具有重要意义。幽门螺杆菌能够在胃的酸性环境中成功定植并导致胃粘膜病变,这与其表达多种毒力因子,粘附素及趋化因子等密切相关。尽管通常认为幽门螺杆菌在胞外定植,然而越来越多的文献结果显示幽门螺杆菌也能在胞内定植。有报道,幽门螺杆菌在胃上皮细胞中定植,能保护细菌逃脱抗生素联合治疗,与治疗后的复发密切相关。针对病原体的入侵,细胞可通过自噬机制来保护自身。细胞处于应激状态时,会产生适应性反应,自噬就是其中一种。自噬的发生是个逐步的过程,首先形成双层膜的自噬小体,包裹着细胞内的碎片、病原体等,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最后溶酶体内的水解酶将包裹物降解。其中,从自噬小体和溶酶体融合至包裹物被降解的过程称为自噬通量。自噬在幽门螺杆菌定植、致病中发挥了重要作用,但是幽门螺杆菌对自噬的调节机制及自噬对菌定植的影响,尚需进一步研究。SIRT1是去乙酰化酶家族的一员,有文献报道,SIRT1分子也参与了自噬的进程,SIRT1介导的自噬对细胞增殖和抵抗应激很重要。SIRT1使许多转录因子去乙酰化,包括FOXO1,NF-κB,p53等,在去乙酰化后,转录因子随后激活自噬相关基因;并且在营养缺乏时,SIRT1还可以使ATG5,7和8去乙酰化来诱导自噬。但是,尚需进一步研究SIRT1是否参与了幽门螺杆菌对自噬的调节过程,并对菌的定植产生影响。在本研究中,我们探究了幽门螺杆菌感染胃粘膜细胞后细菌的定植情况及对自噬通量的影响,并且研究了 SIRT1在其中的作用。另外,我们还研究了自噬通量对幽门螺杆菌定植的影响。研究目的:探究幽门螺杆菌通过调节去乙酰化酶SIRT1,影响自噬通量,促进菌在胃粘膜中的定植机制,为根除幽门螺杆菌感染提供新的靶点。研究方法和结果:1.幽门螺杆菌抑制自噬通量。我们发现,在幽门螺杆菌感染的胃癌细胞(AGS和SGC-7901)中,自噬相关蛋白p62表达增加,LC3II表达增加而LC3I表达降低。因此,我们推测幽门螺杆菌感染胃癌细胞,激活了自噬,但是阻碍了自噬通量。在胃癌细胞AGS和SGC-7901中,转染表达mCherry-EGFP-LC3B蛋白的自噬相关腺病毒后,用自噬通量激活剂EBSS处理或者感染幽门螺杆菌26695,得出同样的结论。接下来,我们利用自噬通量激活剂EBSS和抑制剂Baf-Al分别作用于胃癌细胞(AGS,SGC-7901),然后感染幽门螺杆菌。荧光定量PCR、庆大霉素保护实验和免疫荧光实验结果显示:抑制自噬通量,幽门螺杆菌的定植增加;激活自噬通量,幽门螺杆菌的定植减少。2.幽门螺杆菌下调自噬相关基因SIRT1。我们发现,幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞(AGS,BGC-823,SGC-7901)中,荧光定量实验和Western blot实验结果显示SIRT1表达下降。3.幽门螺杆菌通过RUNX3下调SIRT1表达。我们在JASPAR数据库中分析了 SIRT1的启动子序列,发现了转录因子RUNX3和FOXO3a的结合位点。首先,我们利用FOXO3a的小干扰转染胃癌细胞,荧光定量结果表明SIRT1表达无明显变化。然后,我们利用RUNX3小干扰转染胃癌细胞,结果显示SIRT1表达降低;在胃癌细胞中,转染RUNX3表达质粒,SIRT1表达升高;转染RUNX3(Runt结构域)突变质粒,SIRT1表达无明显变化。以上结果表明在胃癌细胞中RUNX3可以调节SIRT1表达。然后,我们研究RUNX3是否直接调控转录SIRT1。在胃癌细胞AGS中转染RUNX3表达质粒,ChIP实验结果显示RUNX3在SIRT1启动子区聚集。双荧光素酶实验结果显示RUNX3在SIRT1的启动子区具有转录活性。最后,我们做了幽门螺杆菌感染胃癌细胞的回复实验,结果显示过表达RUNX3可以回复由幽门螺杆菌感染引起的SIRT1表达下调。综上可得,幽门螺杆菌下调胃癌细胞中SIRT1的表达受到RUNX3的转录调控。4.幽门螺杆菌抑制SIRT1调节自噬通量。向胃癌细胞中加入SIRT1的特异性小分子激活剂(SRT1720),Western blot和自噬双标腺病毒实验显示,SIRT1的激活剂能够促进自噬通量。在幽门螺杆菌感染的细胞中加入SIRT1激活剂,蛋白结果显示激活SIRT1能够回复由幽门螺杆菌感染抑制的自噬通量。自噬双标腺病毒实验结果得出同样的结论。5.SIRT1通过诱导自噬通量抑制菌的定植。我们利用SIRT1的特异性小分子激活剂(SRT1720)或抑制剂(EX 527)作用于胃癌细胞(AGS,SGC-7901),然后感染幽门螺杆菌。荧光定量PCR、庆大霉素保护实验和免疫荧光实验结果显示:激活SIRT1,幽门螺杆菌的定植减少;抑制SIRT1,幽门螺杆菌的定植增多。在SIRT1抑制剂组通过血清饥饿诱导自噬通量后,幽门螺杆菌的定植显著减少。上述实验说明,SIRT1通过诱导自噬通量抑制菌的定植。6.动物实验。给小鼠分别灌胃幽门螺杆菌SS1和猫螺杆菌H.felis(ATCC 49179),一段时间后,用幽门螺杆菌检测试纸检测灌胃小鼠是否为幽门螺杆菌感染阳性,然后进行后续实验。蛋白检测结果显示:螺杆菌感染小鼠胃组织中SIRT1表达下降,自噬相关蛋白p62表达增加,LC3II表达增加而LC3I表达下降,自噬通量被抑制。对SIRT1基因条件性敲除的小鼠灌胃猫螺杆菌。2个月、6个月后处死小鼠,取胃脏。CFU和荧光定量PCR检测菌的定植情况。结果显示:敲低SIRT1后,幽门螺杆菌定植增加。7.临床标本。收集浅表性胃炎、萎缩性胃炎和异型增生患者的胃组织石蜡切片,将这些石蜡切片分为两组(幽门螺杆菌感染阳性组和阴性组)。免疫组化结果显示:随着病程的进展,SIRT1的表达逐渐降低;并且在各病理阶段,幽门螺杆菌感染阳性组与阴性组相比,SIRT1表达均显著降低。结论:在胃癌细胞及小鼠体内,幽门螺杆菌感染可以激活自噬却抑制自噬通量,并且下调自噬相关基因SIRT1的表达。幽门螺杆菌下调胃癌细胞中SIRT1的表达受RUNX3的转录调控。细胞学实验及回复实验证实,幽门螺杆菌通过抑制SIRT1下调自噬通量,且在胃癌细胞中SIRT1通过诱导自噬通量抑制幽门螺杆菌的定植。在体实验表明,SIRT1条件性敲除的小鼠体内,幽门螺杆菌的定植显著增加。在临床标本中,从浅表性胃炎向萎缩性胃炎、异型增生发展的过程中,SIRT1的表达逐级降低;并且在各病理阶段,幽门螺杆菌感染阳性组与阴性组相比,SIRT1表达均显著降低。